Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D
Summary
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Fluoreszenz beschriften Kollagen, das weiter für beide fix und Live-Darstellung von 3D-Zellkulturen verwendet werden kann. Wir bieten auch ein optimiertes Protokoll endogene Proteine des Zytoskeletts von Zellen in 3D-Umgebungen kultiviert visualisieren.
Abstract
Die Zellmigration wurde traditionell in 2D Substraten untersucht. Es hat sich jedoch zunehmend klar, dass es notwendig ist, die Zellmigration in geeigneter 3D-Umgebungen, die besser ähneln die Dimensionalität der physiologischen Prozesse in Frage zu untersuchen. Wandernde Zellen können im Wesentlichen in ihrer Morphologie und die Art der Migration unterscheiden sich je nachdem, ob sie auf 2D-oder 3D-Substrate bewegt. Aufgrund technischer Schwierigkeiten und Inkompatibilitäten mit den meisten Standard-Protokolle, strukturelle und funktionelle Analyse von Zellen in 3D-Matrices eingebettet bleibt ungewöhnlich. Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Erstellung und Darstellung von 3D-Krebs Zellkulturen, entweder als einzelne Zellen oder Kügelchen. Als geeignete ECM Substrat für Krebs Zellmigration, verwenden wir nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I polymerisiert bei Raumtemperatur und fluoreszenzmarkierte, um die Visualisierung mit Standard Konfokalmikroskopen erleichtern. Diese Arbeit umfasst auch eine Protocol für 3D Immunfluoreszenz Kennzeichnung von endogenen Zelle Zytoskeletts. Mit diesen Protokollen wir hoffen auf eine bessere Beschreibung der molekularen Zusammensetzung, Lokalisierung und Funktionen der zellulären Strukturen in 3D beitragen.
Introduction
Das Feld der Zellwanderung wurde in der brandneuen dritten dimensionalen Welt trotzen. Es ist intuitiv zu Zellwanderung in einer Umgebung, die am ehesten die physiologischen und somit dreidimensionale (3D) zu studieren. Doch aufgrund technischer Einschränkungen haben die meisten Zellwanderung Studien durchgeführt, die Analyse Zellbewegung über starren zweidimensionalen (2D)-Substraten, entweder unbehandelt oder beschichtet mit entsprechenden extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine.
Die ersten Studien gewidmet Zellwanderung im dreidimensionalen Kollagen Gittern zurück über 20 Jahre 1-3. Doch erst in den letzten 5 Jahren ist klar geworden, dass wandernde Zellen konnten im Wesentlichen in ihrer Morphologie und die Art der Migration abhängig von der Dimensionalität des Substrats unterscheiden. In 2D Zellen nur dem Substrat in Berührung mit ihren ventralen Fläche mit fokalen Adhäsionen, was zur Bildung von breiten, flachen Vorsprünge (lamellipodia) miteingebettet Finger Fortsätze (Filopodien) an deren Vorderkante. Diese Strukturen, die mit Stress Fasern, die die Zelle vor Verbindung mit der Hinterkante, wird angenommen, dass entscheidend für Zellbewegung in 2D. In 3D-Matrices sind die Zellen im Allgemeinen länglichen, mit der gesamten Zelloberfläche Kontaktieren der ECM, die zu erheblichen Veränderungen in der Bildung und funktionelle Bedeutung von vielen dieser Strukturen. Umgekehrt gewinnen andere zelluläre Funktionen Relevanz in 3D Migration, wie nukleare Verformung und Strukturen in ECM Umbau 4 beteiligt.
Trotz dieser bekannten morphologischen Veränderungen sowie Unterschiede in der Migration Modi 5-7, die je nach dem ECM-und Zelltypen, strukturelle und funktionelle Analyse von Zellen in 3D-Matrices eingebettet bleibt ungewöhnlich. Arbeiten mit dicke und dichte 3D-Matrices trägt technischen Schwierigkeiten, wie hochauflösende Mikroskopie und Inkompatibilitäten mit den meisten standard Protokolle für 2D-Kulturen optimiert, wie Immunfluoreszenz Kennzeichnung von endogenen Proteinen. Auch, weil die Verwendung von 3D-Matrices ist ein relativ neuer Ansatz sind die Forscher noch untersuchen die besten Voraussetzungen, um ähneln spezifische in vivo Situationen, wie dem normalen Stromazellen Architektur verschiedener Gewebe Organe oder der ECM Organisation um einen Tumor. Diskrepanzen in den Ergebnissen von verschiedenen Gruppen über, zum Beispiel, haben Krebszelle Modi der Migration oder die Existenz von fokalen Adhäsionen, einige Kontroversen 8 erzeugt. Mit viel Aufwand wurde kürzlich eingeweiht, um einen Konsens in Bezug auf ECM chemische Natur, Porengröße, Faser Dicke und Steifigkeit Matrix zu erreichen. Viele verschiedene Arten von 3D-ECM werden derzeit verwendet, variierend von Zellen abgeleiteten Matrizen im Handel erhältlich Matrigel, pepsinized Rinder-Kollagen I oder nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I. Jede dieser Matrizen hat bestimmte physikalische und chemische Eigenschaften und man muss Beziehungente die Matrix der Wahl, um den physiologischen Prozess untersucht. Darüber hinaus kann die Porengröße und Faserdicke auf Polymerisationsbedingungen wie pH-Wert und Temperatur 9,10 abhängen. Die Bindung an und die Entfernung von starren Substraten wie Glas, können auch die elastischen Eigenschaften der Matrix 10,11.
Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Erstellung und Darstellung von 3D-Krebs Zellkulturen, entweder als einzelne Zellen oder Kügelchen. Verfahren zur Herstellung von Krebszellen Sphäroide wurden bisher beschrieben, die populärsten ist der hängende Tropfen Methode 12,13 und die Agarose-beschichtete Platte 14 Verfahren. Als geeignete ECM Substrat für Krebszelle Migration wird nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I bei Raumtemperatur polymerisiert bei 2 mg / ml verwendet. Nonpepsinized Säure extrahierten Kollagen I aus Rattenschwanz behält beide N-und C-terminalen Telopeptide, nichthelicale Teile des Kollagen-Molekül verantwortlich für natives Kollagen intermolekularedere Vernetzung und Stabilität fibrilar 15. Zusammen ermöglichen diese Bedingungen die Bildung von Kollagen-Netzwerke, die am ehesten Ähnlichkeit mit den in vivo 10 beobachtet. Um die Visualisierung der Kollagenfasern, sowohl in fixierten und lebenden Kulturen zu ermöglichen, wird ein ausführliches Protokoll vorgesehen, um Fluoreszenz beschriften Kollagen in vitro 10 mit 5 – (und-6)-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Succinimidylester. Dieses Protokoll wurde von Baici et al angepasst. 16,17, wo Fluoresceinisothiocyanat verwendet wird, um lösliche Kollagen-Moleküle zu markieren. Beispiel Fluorescein ist TAMRA eine Amino-reaktiven Fluoreszenzfarbstoff mit protonierten aliphatischen Aminogruppen von Proteinen, wie z. B. die freie Aminogruppe am N-Terminus und, noch wichtiger, der Seite Aminogruppe von Lysin reagiert. Diese Reaktion tritt nur bei basischem pH-Wert, wenn der Lysin-Aminogruppe in der protonierten Form. Neben TAMRA stabiler als Fluorescein überZeit fällt seine Emissionsspektren auf dem orange / roten Bereich (ex / em = 555/518 nm), die sinnvollerweise für Live Cell Imaging von GFP-markierten Proteine können kombiniert werden. Verwendung von löslichem Kollagen markierten Moleküle mit Amino-Reaktivfarbstoffen hat keinen Einfluss auf die Polymerisation oder die Dichte, Porengröße und Vernetzen Status der Kollagenmatrix 10,16,18,19.
Dieses Protokoll umfasst ferner ein Verfahren für die 3D-Immunfluoreszenz-Markierung von endogenen Proteinen, die weiter optimiert wurde, um die Zytoskelett oder Zytoskelett assoziierte Proteine zu markieren. Der letzte Schwerpunkt dieses Protokoll ist auf Methoden, um hochauflösende Bilder von 3D-Kulturen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie mit reduzierter Beitrag von starren Deckgläschen auf die Kollagen-Matrix Spannung zu erwerben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zur Fluoreszenz beschriften Kollagen I mit TAMRA bietet eine hervorragende Methode, um einfache Visualisierung des Kollagens Netzwerk-Organisation zu ermöglichen, durch die Verwendung eines Standard-konfokalen Mikroskop mit einer 561-nm-Laser ausgestattet. Ein Vorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu Reflexionsvermögen konfokale Mikroskopie ist die Fähigkeit, Bild Kollagenfasern tiefer in die 3D-Matrix. Die Intensität und der Kontrast der Fasern Reflexion deutlich sinkt mit der Tiefe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) für Bild-Erfassung und Verarbeitung in Abbildung 3 und PICT-IBISA Imaging Facility (Institut Curie). Komplexe in vitro zellulären Modellen – Diese Arbeit wurde von ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 und PIC 3D unterstützt.
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
Riferimenti
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