Avslører cytoskeletal Organisering av invasiv kreft celler i 3D

Summary

Denne artikkelen presenterer en metode for å fluorescently merke kollagen som kan videre brukes for både fiks og levende avbildning av 3D cellekulturer. Vi tilbyr også en optimalisert protokollen til å visualisere endogene cytoskeletal proteiner av celler dyrket i 3D-miljøer.

Abstract

Celle migrasjon har tradisjonelt blitt studert i 2D underlag. Imidlertid har det blitt mer og mer tydelig at det er et behov for å studere cellemigrering i mer hensiktsmessige 3D-omgivelser, noe som bedre ligner den dimensjonalitet de fysiologiske prosessene det gjelder. Trekkende celler kan betydelig ulik morfologi og modus for migrasjon avhengig av om de beveger seg på 2D eller 3D underlag. På grunn av tekniske problemer og kompatibilitetsproblemer med de fleste standard protokoller, strukturell og funksjonell analyse av celler innebygd i 3D-matriser fortsatt uvanlig. Denne artikkelen beskriver metoder for forberedelse og avbildning av 3D kreft cellekulturer, enten som enkeltceller eller sfæroider. Som en passende ECM substrat for kreft celle migrasjon, bruker vi nonpepsinized rotte hale kollagen jeg polymerisert ved rom-temperatur og fluorescensmerkede å lette visualisering ved hjelp av standard confocal mikroskoper. Dette arbeidet inkluderer også en protocol for 3D immunofluorescent merking av endogene celle cytoskeleton. Ved hjelp av disse protokollene vi håper å bidra til en bedre beskrivelse av molekylære sammensetning, lokalisering og funksjoner av cellulære strukturer i 3D.

Introduction

Feltet av celle migrasjon har trosset inn i den splitter nye tredimensjonale verden. Det er intuitivt å studere celle migrasjon i et miljø som ligner mest på det fysiologiske og derfor tredimensjonale (3D). Men på grunn av tekniske begrensninger, har de fleste cellemigrering studier er gjort analysere celle bevegelse over stive to-dimensjonal (2D) substrater, enten ubehandlet eller overtrukket med egnede ekstracellulære matriks (ECM) proteiner.

De første studiene dedikert til celle migrasjon i tredimensjonale kollagen gittere gå tilbake over 20 år ^1-3. Men bare i løpet av de siste fem årene har det blitt klart at trekkende cellene kunne vesentlig ulik morfologi og modus for migrasjon avhengig av dimensjonalitet av underlaget. I 2D, celler bare berøre substratet med sin ventrale overflaten ved hjelp av fokal adhesjon, noe som resulterer i dannelsen av brede flate fremspring (lamellipodia) medinnebygde finger-lignende fremspring (filopodia) på sitt forkant. Disse strukturer, sammen med stress-fibrene som forbinder cellen fremre til den bakre kant, antas å være avgjørende for celle bevegelse i 2D. I 3D-matriser, celler er generelt mer langstrakt, med hele celleoverflaten kontakter ECM, forårsaker betydelige endringer i formasjonen og funksjonell relevans av mange av disse strukturer. Omvendt, andre cellulære funksjoner få relevans i 3D migrasjon, for eksempel kjernefysisk deformasjon og strukturer involvert i ECM ombygging ^fire.

Til tross for disse kjente morfologiske forandringer, så vel som forskjeller i migrasjon modi ^5-7, som kan variere avhengig av ECM-og celletyper, strukturell og funksjonell analyse av celler som integrert i 3D matriser gjenstår fremdeles uvanlig. Arbeide med tykke og tette 3D-matriser bærer tekniske problemer, som for eksempel høy oppløsning mikroskopi bildebehandling, og kompatibilitetsproblemer med mest standard protokoller optimalisert for 2D kulturer, som immunofluorescent merking av endogene proteiner. Også, fordi bruken av 3D-matriser er en relativt ny tilnærming, er forskerne fortsatt etterforsker de beste forutsetninger for å ligne spesifikk in vivo situasjoner, for eksempel normal stromal arkitekturen i ulike vev organer eller ECM organisasjonen rundt en svulst. Avvik i resultatene fra ulike grupper om, for eksempel, har kreftcelle moduser av migrasjon eller eksistensen av fokale sammenvoksninger, generert en del kontrovers ^åtte. Mye arbeid har nylig blitt dedikert til å nå en enighet i form av ECM kjemiske natur, pore størrelse, fiber tykkelse, og matrise stivhet. Mange forskjellige typer 3D ECMS brukes i dag, varierende fra celle avledet matriser til kommersielt tilgjengelig matrigel, pepsinized kollagen I, eller nonpepsinized rotte hale kollagen I. Hver av disse matriser har spesifikke fysiske og kjemiske egenskaper og man trenger til forholdte matrisen av valget til den fysiologiske prosessen som studeres. I tillegg kan porestørrelsen og fibertykkelse avhenge av polymerisasjonsbetingelsene, slik som pH og temperatur ^9,10. Binding til og avstand fra stive underlag som glass, kan også endre de elastiske egenskapene til matrisen ^10,11.

Denne artikkelen beskriver metoder for forberedelse og avbildning av 3D kreft cellekulturer, enten som enkeltceller eller sfæroider. Fremgangsmåter for fremstilling av kreftcelle sfæroider tidligere har blitt beskrevet, er de mest populære blir den hengende dråpe-metoden ^12,13 og agarose-belagt plate-metoden ^14.. Som et passende substrat for ECM kreft cellemigrering, er nonpepsinized rottehale collagen I polymeriseres ved rom-temperatur ble brukt ved 2 mg / ml. Nonpepsinized syreekstraherte kollagen jeg fra rotte hale beholder både N-og C-terminal telopeptider, nonhelical deler av kollagen molekylet ansvarlige for native kollagen intermolecular tverrbindingssystem og fibrilar stabilitet ^15. Sammen utgjør disse forholdene tillater dannelsen av kollagen nettverk som mest ligner de som er observert in vivo ^10. Slik tillater visualisering av kollagenfibre, både i faste og levende kulturer, er en detaljert protokoll gitt til fluorescently merke kollagen in vitro ¹⁰ bruker 5 – (and-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimidyl ester. Denne protokollen har blitt tilpasset fra Baici et al. ^16,17, hvor fluorescein-isotiocyanat blir brukt til å merke løselige kollagen molekyler. Som fluorescein, TAMRA er en amino-reaktivt fluorescerende fargestoff som reagerer med nonprotonated alifatiske aminogrupper av proteiner, som for eksempel den frie aminogruppen ved N-terminus, og, enda viktigere, siden aminogruppen i lysines. Denne reaksjon forekommer bare ved basisk pH, når lysin aminogruppen er i nonprotonated formen. I tillegg til TAMRA å være mer stabil enn fluorescein løpettid, faller utslippsforpliktelsen spektra på den oransje / røde området (ex / em = 555/518 nm), som kan være nyttig kombinert for live cell imaging av GFP-merket proteiner. Ved hjelp av oppløselig collagen merkede molekyler med amino-reaktive fargestoffer påvirker ikke polymerisasjonsprosessen eller tettheten, porestørrelse og tverrbinding status for kollagenmatriksen ^10,16,18,19.

Denne protokollen innbefatter også en fremgangsmåte for 3D immunofluorescerende merking av endogene proteiner, som er ytterligere optimalisert for å merke cytoskjelettet eller cytoskjelett assosierte proteiner. Den endelige fokus for denne protokollen er på metoder for å skaffe høyoppløselige bilder av 3D-kulturer ved hjelp konfokalmikroskopi med redusert bidrag fra stive glass Dekkglass på kollagen matrise spenning.

Protocol

En. TAMRA-kollagen I Merking Forbered en 10 mg / ml TAMRA løsning ved å tilsette 2,5 ml DMSO til det 25 mg TAMRA pulver. Oppløs det ved omrøring inntil fullstendig oppløsning. Oppbevares ved -20 º C og beskytte mot lys. Forbered 2 l Merking Buffer (0.25 M 3 NaHCO, 0,4 M NaCl). Juster pH til 9,5 ved anvendelse av 10 M oppløsning av NaOH. Lagres ved 4 º C. Fra dette punktet, blir alle operasjoner utført ved 4 º C, med mindre annet er oppgitt og fluoriserende materiale er beskyttet…

Representative Results

Merking rotte-hale kollagen jeg med TAMRA gir en enkel forberedelse og visualisering av 3D kollagen nettverk. Slow polymerisasjon ved romtemperatur resulterer i dannelsen av kollagen nettverk med tilsvarende organisasjon til de som finnes i vivo 10. Her presenterer vi en protokoll for immunfluorescens farging av cytoskjelettet av CT26 kreftceller, både som sfæroider og som enkeltceller. For bedre å bevare cytoskjelettet, er buffere supplert med umerket phalloidin og No…

Discussion

Protokollen er beskrevet her for å fluorescently merke kollagen jeg bruker TAMRA gir en utmerket metode for å tillate enkel visualisering av kollagen nettverksorganisasjon, ved hjelp av en standard konfokalmikroskop utstyrt med en 561 nm laser. En fordel med denne teknikken å sammenligne reflektans konfokal mikroskopi er evnen til bildet kollagenfibre dypere inn i 3D matrise. Intensiteten og kontrast i fibrene refleksjon avtar vesentlig med dybden på grunn av laserlys absorpsjon og spredning. Dessuten kan orienterin…

Materials

TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane