Isolering og Th17 Differentiering af Naïve CD4 T-lymfocytter

Summary

Med effektorfunktioner adskiller sig fra andre T-celle delmængder, har Th17 celler blevet centralt impliceret i inflammatoriske autoimmunitet. Denne in vitro Th17 differentiering protokol giver et middel til at afgøre, om naive CD4 + T-lymfocytter kan differentiere sig Th17 celler, og for yderligere at undersøge deres rolle i autoimmunitet og vært reaktion.

Abstract

Th17 celler er et særskilt undersæt af T-celler, har vist sig at producere interleukin 17 (IL-17) og adskiller sig i funktion fra de andre T-celledelmængder, herunder Th1, Th2 og regulatoriske T-celler. Th17 celler er dukket op som en central synder i nidkære inflammatoriske immunrespons er forbundet med mange autoimmune sygdomme. I denne fremgangsmåde rense vi T-lymfocytter fra milt og lymfeknuder fra C57BL / 6 mus, og stimulerer oprensede CD4 + T-celler under kontrol og Th17-inducerende miljøer. Den Th17-inducerende miljø omfatter stimulering i nærvær af anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer, IL-6 og TGF-β. Efter inkubation i mindst 72 timer, og i op til fem dage ved 37 ° C, cellerne efterfølgende analyseret for evnen til at producere IL-17 ved hjælp af flowcytometri, qPCR og ELISA'er. Th17 differentierede CD4 + CD25-T-celler kan anvendes til yderligere at belyse den rolle, Th17 celler spiller i indtræden og progression af autoimmunitet og vært defense. Desuden kan Th17 differentiering af CD4 + CD25-lymfocytter fra forskellige murine knockout / sygdomsmodeller bidrage til vores forståelse af celle skæbne plasticitet.

Introduction

CD4 +-T-lymfocytter (T-celler) spiller en kritisk rolle i immunsystemet-medieret forsvar mod infektiøse mikroorganismer. Omvendt er T-celler også tæt forbundet med indtræden og progression af autoimmune sygdomme som type 1 diabetes, systemisk lupus erythematosus, og leddegigt. CD4 +-T-lymfocytter er blevet aktiveret ved en kombination af T-cellereceptor (TCR) interaktioner med dertil hørende antigen / major histocompatibility complex II (MHCII)-molekyler og CD28-receptor interaktioner med B7.1/B7.2 ligander ^15. Ud over tilvejebringelse af TCR-stimulering og CD28 costimulering, antigenpræsenterende celler giver også et cytokin miljø, der bestemmer differentieringstilstanden af ​​T-lymfocyt, hvorved dirigere T-lymfocyt respons på det givne antigen. Tydelige patogen / antigen-præsenterende celle interaktioner skabe distinkte cytokin-miljøer, som en skævhed T-lymfocytter ned adskilte veje fokuseret på elimelse af den initierende patogen. Desværre T lymfocyt effektor veje, der oprindeligt designet til at udrydde invaderende patogener, kan fejlagtigt rettet mod selv-væv ^15. Derfor bedre forståelse af hvert enkelt CD4 + T-celle delmængde differentiering tilstand er kritisk for vores forståelse af, hvordan man kan modulere balancen mellem eliminering af patogener og tolerance over for selv.

Ud over Th1, Th2 og inducerbare regulatoriske T-celler veje kan naive T-lymfocytter også være drevet af cytokiner ned Th17 vej. Betragtninger Th1 celler bekæmpe intracellulære patogener, Th2 celler fjerne ekstracellulære patogener, og regulatoriske T-celler (tregs) minimere inflammatoriske reaktioner ^{1, 16,} Th17 celler spiller en vigtig rolle i afskaffelsen af ekstracellulære bakterier og svampe. Th17 celler generelt betegnet ved ekspression af linjespecifikt transkriptionsfaktor RORγT og produktion af IL-17A, som fremmer aktiveringen af makrofager og neutrofiler ^{1, 7.}

Th17 celler har været impliceret i flere autoimmune sygdomme og deres tilknyttede gnavermodeller. For eksempel er det blevet påvist, at IL-23 (som er nødvendig til at opretholde Th17 fænotype), men ikke IL-12, var den centrale årsag i eksperimentel autoimmun encephalitis (EAE), gnavere sygdom model for MS. Det har efterfølgende vist sig, at reduktioner i IL-17 produktion er korreleret til EAE forebyggelse ^{2, 6, 17.} Desuden har Th17 celler blevet forbundet med andre autoimmune sygdomme, herunder arthritis og systemisk lupus erythematosus (SLE) ^{10, 16..} IL-23 deficient p19 ^{– / –} mus blev vist at have meget lave antal Th17 celler og er modstandsdygtig over for at udvikle ikke kun EAE, men også collagen-induceret arthritis, en model for rheumatoid arthritis ^{10, 18.} Desuden mus behandlet med neutraliserende IL-17A antistoffer agtenis indtræden af kollagen-induceret arthritis blev også fundet at have opløsning af ledskader ^18. Det skal bemærkes, at den rolle Th17 celler i udviklingen af autoimmun sygdom er fortsat at blive karakteriseret som nyere forskning har også vist en beskyttende rolle i Th17 celler i type 1 diabetes ^{9, 11} og tarmbetændelse ^14. Disse undersøgelser bekræfter betydningen af ​​Th17 differentiering i autoimmunitet.

In vitro Th17 skelnen er en nødvendig metode i T-celle forskning, fordi der er mindst to forvirrende spørgsmål, der kræver yderligere undersøgelse: 1) Hvor præcis er IL-6 regulerer balancen mellem Treg og Th17 differentiering, og 2) hvad er de nøjagtige mekanismer bag IL-17-inducerede inflammatoriske lidelser? Vores metode anvender CD4 + CD25-T-celler fra milt og lymfeknuder fra C57BL / 6 mus. Det er vigtigt at bemærke, at selvom det er muligt at inducere Th17 differentiering ved hjælp af en urenbefolkning, erhverve mindst en 80% ren CD4 + CD25-T-celle population negerer enhver bekymring for forurening og sikrer mere vellykkede Th17 differentiering resultater. For at opnå ordentlig Th17 differentiering, er CD4 + CD25-T-celler inkuberet i nærvær af anti-CD3 og anti-CD28, som giver aktiveringssignaler, 1 og 2, henholdsvis, og IL-6 og TGF-β. Selv om det er blevet rapporteret, at IL-23 alene kan anvendes til at opnå Th17 differentiering, blev det senere vist, at IL-23 er nødvendig for stabiliteten af ​​Th17 cellepopulationen, men IL-6 og TGF-β er afgørende for Th17 differentiering ^{3, 18, ​​19.} Murine undersøgelser har vist, at IL-23-receptoren udtrykkes på CD4 + T-celler, efter de er blevet stimuleret med IL-6 og TGF-β ^{13, 18.} Desuden vil Th17 celler med succes udvikler sig i nærværelse af IL-23-blokerende antistoffer, så længe IL-6 og TGF-β er til stede ^{18, 19.} Som sådan Th17 differentiering denne protokol provIdes de rette betingelser for en vellykket fremkalde Th17 differentiering. Udvikling af en bedre forståelse af de mekanismer, der ligger til grund Th17 differentiering og IL-17 produktion præsentere mulighed for udvikling af bedre lægemidler rettet mod autoimmune sygdomme ^13.

Protocol

Alle dyr brug blev gennemført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg. 1.. Udarbejdelse af Blandinger og medier Steril PBS pH: 7,3 (1 L) 0,23 g NaH 2 PO4 1,15 g Na 2 HPO 4 9,0 g NaCl Tages op volumen med DI vand. Sterilisere med autoklavering. Cell Culture Media (100 ml) 89 ml RPMI 10 ml 10%…

Representative Results

Denne Th17 differentiering protokol begynder med fjernelse af milten og aksillær, brachialis, mesenterial, livmoderhalskræft, og lyske lymfeknuder. En repræsentation af placeringen af hver kan findes i figur 2 og 3.. Figur 1 og 5 både give en visuel repræsentation af de metoder, der er beskrevet i denne protokol. Denne Th17 protokol fokuserer på differentiering fra CD4 + CD25-T-lymfocyt befolkning. Det er vigtigt at bemærke, hvor effe…

Discussion

Her har vi beskrevet protokollen for at opnå in vitro Th17 differentiering. Studiet af Th17 differentiering er vigtig, da differentiering af T-lymfocytter i Th17 delmængde er kritisk for effektiv eliminering af humane patogener ^13. Omvendt har IL17 produktion blevet forbundet med autoimmun sygdom progression ^13. Fremgangsmåden ifølge Th17 differentiering er anvendelig til mange forsknings indstillinger som den kan anvendes til mange forskellige murine modeller af immune regulering og a…

Materials

			Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted	Fisher Scientific	12-544-3	3″ x 1″1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 microns	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e	BD Biosciences	553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28	BD Biosciences	553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R&D Systems	240-B-002
Trypan blue solution 0.4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17	BD Biosciences	560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol	MP Biomedical	194834	Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Hazardous
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Capture mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detection mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Substrate Reagent Set	BD Biosciences	555214
			Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge	ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator	ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Biorad