Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay
Summary
Verfahren zur Synthese von luftempfindlichen Titan-und Vanadiumantikrebsmitteln wird beschrieben, zusammen mit der Bewertung der zytotoxischen Aktivität gegenüber menschlichen Krebszelllinie mit dem MTT-Assay.
Abstract
Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe sind hochwirksamen Antikrebsmittel. Eine Herausforderung bei ihrer Synthese bezieht sich auf ihre hydrolytische Instabilität, deshalb sollte deren Herstellung unter einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden. Bewertung der Antitumor-Aktivität dieser Komplexe können durch den MTT-Assay erzielt werden.
Der MTT-Test ist ein kolorimetrischer Assay, der auf Lebensfähigkeit enzymatischen Reduktion von MTT zu Formazan-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt ist. Das Ergebnis der Reduzierung ist ein Farbwechsel des MTT-Molekül. Absorptionsmessungen relativ zu einem Regler zum Einstellen des Prozentsatzes der verbleibenden lebensfähigen Krebszellen nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen einer Testverbindung, die Aktivität gegen Krebs der Verbindung und ihrer IC 50-Werte umgerechnet wird. Der MTT-Assay ist in Zytotoxizität Studien aufgrund ihrer Genauigkeit, Schnelligkeit und relative Einfachheit weit verbreitet.
Hier stellen wir vorschickte detailliertes Protokoll für die Synthese von luftempfindlichen Metall basierte Medikamente und die Lebensfähigkeit der Zellen-Messungen, einschließlich der Vorbereitung der Zellplatten, die Inkubation der Verbindungen mit den Zellen, die Lebensfähigkeit Messungen unter Verwendung des MTT-Tests, und die Bestimmung der IC 50-Werte.
Introduction
Die Chemotherapie ist immer noch eines der Hauptgerichte von Behandlungen in der Klinik für verschiedene Krebserkrankungen eingesetzt und damit überwiegende Teil der Forschung wird weltweit mit dem Ziel, neue und verbesserte Krebsmedikamente entwickeln, durchgeführt. Solche Studien beginnen meist in der chemischen Ebene, mit der Gestaltung und Herstellung von Verbindungen, gefolgt von biologischen Auswertung der zytotoxischen Eigenschaften in vitro. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch verschiedene Tests, die Informationen über die Zellaktivität bieten 1-2 bewertet werden.
Cisplatin ist ein Beispiel eines Platinkomplexes, der weitgehend als chemotherapeutisches Arzneimittel, die als eine effiziente Behandlung hauptsächlich für Hoden-und Eierstockkrebs 3-4 verwendet wird. , Seinen engen Aktivitätsbereich und schwere Nebenwirkungen auslösen, jedoch Studien anderer potenter Übergangsmetallkomplexe 5-8. Unter anderem Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe zeigten vielversprechende Ergebnisse mit hoher Aktivität und reduzierteToxizität 16.9. Ti (IV)-Komplexe waren die ersten klinischen Studien nach Cisplatin aufgrund dieser Eigenschaften geben, allerdings haben sie die Studien aufgrund Formulierungsschwierigkeiten und hydrolytische Instabilität fehlgeschlagen. Es besteht daher ein Bedürfnis, verbesserte Strom Derivate dieser Metallkomplexe, die eine hohe Anti-Krebs-Aktivität mit Wasserbeständigkeit 15,17-21 kombinieren entwickeln.
Eine Herausforderung bei der Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Komplexe bezieht sich auf die hydrolytische Instabilität der Vorläuferreagenzien, daher inerte Atmosphäre aufrechterhalten werden. Die Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Verbindungen wird unter N 2 oder Ar Bedingungen in einem Handschuhfach oder unter Verwendung von Schlenk-Techniken durchgeführt.
Test – Ein übliches Verfahren zur Bewertung der Anti-Krebs-Aktivität basiert auf dem MTT-((4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid 3) bezogen. Dieser Test ist ein Test, der farbmetrischen Rentabilität im Jahr 1983 von Mosmann präsentiert wurde22. Es ist sehr gut untersucht und charakterisiert, und es wird als sehr leistungsfähig bei der Beurteilung der Wirksamkeit der neuen zytotoxischen Verbindungen aufgrund ihrer Präzision, Schnelligkeit und seine Fähigkeit, auf einer Vielzahl von Zelllinien verwendet werden. Diese Lebensfähigkeit Assay basiert auf der Farbänderung des MTT-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt basiert. Messung der Absorption bestimmt, die proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ist, und der Vergleich zu unbehandelten Kontrollen, erlaubt die Beurteilung der Zellwachstumshemmung Fähigkeiten der getesteten Verbindung.
Der MTT-kolorimetrischen Assay wird in 96-Well-Plattenformat 23 geleitet. Die Zellen können Vorinkubation in den Vertiefungen vor der Zugabe des getesteten Arzneimittels erforderlich. Die Vorinkubation Zeiten 0-24 Stunden nach der Zelllinie Eigenschaften variieren. Die Zellen werden in der Regel auf die Droge für 24-96 Stunden in Abhängigkeit von der Wirkstoffaktivität ausgesetzt. MTT-Lösung wird dann zu der behandelten Zellen, in denen die Schrei hinzugefügtow MTT zu Formazan lila durch eine Vielzahl von mitochondrialer und cytosolischer Enzyme, die in betriebsfähiger Zellen (Fig. 1) 24 verringert. Der MTT-Molekül nicht durch tote Zellen oder roten Blutzellen (metabolisch inaktiven Zellen) Milzzellen (ruhende Zellen) und Concanavalin A-stimulierten Lymphozyten (aktivierte Zellen) 22 verringert. Nach 3-4 h Inkubation mit MTT Formazan die Niederschläge. Die Bildung des Formazan beginnt nach 0,5 h Inkubation aber für optimale Ergebnisse ist es am besten, um die Zellen zu MTT für mindestens 3 h 22 freizulegen. Folglich wird das Wachstumsmedium entfernt und die Formazan wird in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt Isopropanol 25 gelöst, obwohl DMSO kann auch verwendet werden 26. Die Beseitigung des Mediums ist für genaue Ergebnisse zu erzielen, da Phenolrot, die in Wachstumsmedium weit verbreitet ist, und Ausfällen von Proteinen mit der Absorptionsmessung 25 stören. Wenn die formaZan homogene Lösung erreicht, die Absorption der Lösung wird unter Verwendung eines Mikroplatten-Lese Spektrophotometer gemessen. Die Absorption bei 550 nm ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen im Bereich von 200-50,000 Zellen pro Vertiefung, und somit können sehr kleine Mengen von 22 Zellen nachgewiesen werden. Die Absorption zeigt die Menge an lebensfähigen Zellen, die nach der Behandlung mit dem Arzneimittel blieb, und ist mit der Absorption von Kontrollzellen, die nicht mit dem Arzneimittel ausgesetzt waren, verglichen. Analyse der Ergebnisse durch geeignete Software stellt die IC 50 (Inhibierung Konzentration, 50%)-Werte und ihre statistische Fehler auf der Grundlage mehrerer Wiederholungen der Messung.
Der MTT-Assay ist weit verbreitet in Zytotoxizitätsuntersuchungen für das Screening neuer Antikrebsverbindungen aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Genauigkeit. Jedoch bei der Verwendung des MTT-Tests, die auf enzymatische Reaktion abhängig ist, man bedenken muß, daß verschiedene Enzyminhibitoren können die Reduktion von MTT Affektd zu falschen Ergebnissen führen 27. Darüber hinaus bedeutet das MTT-Assay keine Information über den molekularen Mechanismus der zytotoxischen Aktivität des Wirkstoffs 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in dieser Handschrift beschriebenen Methode kombiniert die chemische Synthese mit biologischen Zelllebensfähigkeitstest. Wie bei allen biologischen Methoden zur lebensfähigen Zellen, ist es wichtig, in einer laminaren Haube arbeiten und sterilen Bedingungen, einschließlich der Verwendung von sterilen organischen Lösungsmitteln zu halten. Auch sollte der Herstellung und Lagerung von hydrolytisch instabilen Metall basierte Medikamente unter inerten Bedingungen durchgeführt werden, für das Handschuhfach oder-Schl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung wurde von der Europäischen Forschungsrates des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft (FP7/2007-2013) empfangen / ERC-Finanzhilfevereinbarung Nr. [239603]
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette |
Riferimenti
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
- Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
- Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
- Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
- Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
- Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
- Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
- Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
- Meléndez, E. Titanium complexes in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).
- Evangelou, A. M. Vanadium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).
- Djordjevic, C. Antitumor activity of vanadium compounds. Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).
- Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. Anticancer titanium agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).
- Caruso, F., Rossi, M. Antitumor titanium compounds. Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).
- Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
- Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance. European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).
- Buettner, K. M., Valentine, A. M. Bioinorganic Chemistry of Titanium. Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).
- Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
- Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
- Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
- Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
- Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival – Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
- Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival – Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
- Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Ricerca sul cancro. 48, 589-601 (1988).
- Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
- Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
- Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
- McCarthy, N. J., Evan, G. I. . Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).
