Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

Summary

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Abstract

Inspanningen gericht op het ontwikkelen van in vitro assays voor de studie van microvaatjes omdat in vivo dierstudies zijn tijdrovend, duur en observatie en kwantificering zijn zeer uitdagend. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje hebben beperkingen als die in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie en een continue vloeistofstroom. Met behulp van een combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics, hebben we een multi-diepte cirkelvormige dwarsdoorsnede endotheel microkanalen-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie flow. Een positieve herplaatsbaar fotolak werd gebruikt om een ​​meester mal te fabriceren met een halfronde dwarsdoorsnede microchannel netwerk. Door de afstemming en binding van de twee polydimethylsiloxaan (PDMS) microchannels replvoor bestemde van de meester mal, werd een cilindrische microchannel netwerk gecreëerd. De diameters van de microkanalen kan goed worden gecontroleerd. Bovendien primaire humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) gezaaid in de chip bleek dat de cellen gevoerd het binnenoppervlak van de microkanalen in gecontroleerde perfusie die gedurende een tijdsperiode tussen 4 dagen tot 2 weken.

Introduction

Microvaatjes als onderdeel van het circulatiesysteem, bewerkstelligen de interactie tussen bloed en weefsels, ondersteunen metabolische activiteiten definiëren weefsel micro en spelen een belangrijke rol in vele gezondheids en pathologische omstandigheden. Recapitulatie van functionele microvaatjes in vitro kan een platform voor de studie van complexe vasculaire fenomenen. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje, zoals endotheliale celmigratie testen buisvorming endotheliale assays en ratten en muizen aortaring assays, in staat zijn de opnieuw in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie als continu control ^1-8. Studies microvaatjes met dierlijke modellen en in vivo assays, zoals corneale angiogenese assay, kuiken chorioallantoïsmembraan angiogenese assay en Matrigel plug assay, zijn tijdrovend, in hoge kosten, uitdaging met betrekking tot waarneming en kwantificering enethische kwesties ^{1, 9-13.}

Vooruitgang in micromanufacturing en microfluïdische chip technologieën hebben verschillende inzichten mogelijk in biomedische wetenschappen terwijl vermindering de experimentele hoge kosten en complexiteit van de dieren in vivo studies ^14, zoals gewoon strak gecontroleerde biologische omstandigheden en dynamische vloeibare milieus, die niet zou mogelijk met conventionele technieken macroschaal.

Hier presenteren we een aanpak om een endotheel construeren microchannels-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie stroom door gebruik te maken van de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics.

Protocol

1. Fotolithografie Fabrication van Photoresist Master Mold Het volgende protocol toont het proces om de microkanalen fabriceren met een diameter tussen 30-60 um. Een microkanaal komen met een kleinere diameter (kleiner dan 30 urn), een spin-coating fotoresist nodig. Breng de reflow fotolak van de koelkast bij 4 ° C tot de cleanroom 24 uur voor gebruik en laat het opwarmen tot kamertemperatuur. Schoon een silicium wafer en bak het gedurende een uur bij 150 ° C om deze t…

Representative Results

Onze benadering van de multi-diepte microkanaal netwerk vervaardigen bootst de complexe 3D geometrieën van in vivo microvaatjes, waarbij de microkanalen afgeronde doorsneden 15. Bovendien, de diameters van de ouder vertakkende kanalen en dochter kanalen ongeveer gehoorzamen Murray wet handhaven de fluïdumstroom op een vereist niveau, zodat de totale kanaal weerstand laag en stroomsnelheden zijn gelijk voor het gehele netwerk 16-18. De procedure en de resultaten voor de vervaardiging van …

Discussion

1. Meester schimmel fabricage

Een van de ontwerpen en de leidende beginselen voor vasculaire morphometry staat bekend als Murray's wet ^16, waarin staat dat de verdeling van het schip diameters in het gehele netwerk wordt beheerst door minimale energie overweging. Het bepaalt ook dat de kubus van de diameters van een ouder schip op een vertakking is gelijk aan de som van de kubussen van de diameters van de dochter schepen ( <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="0.9in" …

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Staining	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 and PKH26GL
Fibronectin	Gibco	PHE0023
L-Glutamine	Sigma	G7513
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14040-133
HEPES Buffered Saline Solution	Lonza	CC-5024
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-062
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
PDMS Curing Agent	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-501F
Diluent C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Molecular Probes	R37605
Dextran	Sigma	95771
3.5% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator	BelArt Products	999320237
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti
Syringe Pump System	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer	Thinky	ARE-310
Isotemp Oven	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Optical Microscope	Zeiss	Invertoskop 40C
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Hotplate	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510