Förfarandet för utarbetande av Multi-djup Cirkulär Tvärsnitt Endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip
Summary
En microchannels-on-a-chip plattform har utvecklats av en kombination av fotolitografiska omsmältbart fotoresist teknik, mjuk litografi och microfluidics. Den endothelialized mikrokanaler plattformen härmar tredimensionella (3D) geometri in vivo mikrokärl, springer under kontrollerade kontinuerlig perfusion flöde, möjliggör hög kvalitet och i realtid avbildning och kan sökas mikrovaskulära forskning.
Abstract
Ansträngningar har fokuserat på att utveckla in vitro-analyser för att studera mikrokärlen eftersom in vivo djurstudier är mer tidskrävande, dyra och observation och kvantifiering är mycket utmanande. Emellertid konventionell in vitro mikrokärlsbildning analyser har begränsningar när de representerar in vivo mikrokärl med avseende på tredimensionella (3D) geometri och tillhandahålla kontinuerlig vätskeflöde. Med en kombination av fotolitografisk omsmältbart fotoresist teknik, mjuk litografi och microfluidicsen, har vi utvecklat en multi-djup cirkulära tvärsnitt endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip, som härmar 3D geometri in vivo mikrokärlen och körs under kontrollerad kontinuerlig perfusion flöde. En positiv flödas fotoresist användes för att tillverka ett huvudsakliga gjutformen med en halvcirkulär tvärsektion mikrokanaler. Genom anpassningen och bindning av de två polydimetylsiloxan (PDMS) mikrokanaler replicated från master mögel, en cylindrisk mikrokanaler skapas. Diametrarna hos mikrokanaler kan kontrolleras väl. Dessutom visade primära humana umbilikalven endotelceller (HUVEC) ympade inuti chipet att cellerna fodrade innerytan av mikrokanalerna under kontrollerad perfusion varar under en tidsperiod mellan 4 dagar till 2 veckor.
Introduction
Mikrokärl, som en del av cirkulationssystemet, förmedlar växelverkan mellan blod och vävnader, stödja metaboliska aktiviteter, definiera vävnaden mikromiljö, och spelar en avgörande roll i många hälso-och sjukdomstillstånd. Rekapitulation av funktionella mikrokärl in vitro kunde ge en plattform för studier av komplexa vaskulära fenomen. Men konventionell in vitro mikrokärlsbildning analyser, såsom endotelceller analyser cell migration, endotelceller rör analyser bildning och råtta och mus aorta analyser ring, kan inte återskapa in vivo mikrokärl avseende tredimensionella (3D) geometri och kontinuerlig flödeskontroll 1-8. Studier av mikrokärl med djurmodeller och in vivo, till exempel hornhinnan angiogenes analys, chick korioallantoismembranet angiogenes analys och Matrigel plug-analysen, är mer tidskrävande, hög kostnad, utmanande när det gäller observation och kvantifieringar, ochväcka etiska frågeställningar 1, 9-13.
Framsteg inom mikrotillverkning och mikrofluidiska teknik chip har möjliggjort en mängd insikter i biomedicinsk vetenskap samtidigt inskränka de höga experimentella kostnader och svårigheter i samband med djur och in vivo studier 14, som lätt och hårt kontrollerade biologiska förhållanden och dynamiska fluidiska miljöer, som inte skulle ha varit möjligt med konventionella makroskala tekniker.
Här presenterar vi en metod för att konstruera en endothelialized mikrokanalerna-on-a-chip som efterliknar 3D geometri in vivo mikrokärlen och körs under kontrollerade kontinuerlig perfusion flöde genom att använda en kombination av fotolitografiska omsmältbart fotoresist teknik, mjuk litografi och microfluidics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett. Mästare mögel tillverkning
En av de designa och vägledande principer för vaskulär morfometri kallas Murrays lag 16, vilket innebär att utdelningen av fartyget diametrar hela nätverket styrs av minimal energi övervägande. Det anges också att kuben av diametrar på en förälder kärl vid en bifurkation är lika med summan av kuberna av diametrarna av dottern fartyg ( <img alt="Ekvation 1" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" src="…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har delvis stöd av National Science Foundation (NSF 1.227.359), WVU EPSCoR program som finansieras av National Science Foundation (EPS-1.003.907), WVU ADVANCE kontor sponsras av National Science Foundation (1.007.978), och WVU PSCoR, respektive. Den mikrofabrikation arbetet gjordes i WVU delade forskningsresurser (Renrumsutrymmen) och Microfluidic integrativ Cellular Forskning om Chip Laboratory (mikrochip Lab) vid West Virginia University. Den konfokala avbildning gjordes vid WVU mikroskopavbildningssystemet Facility.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
Riferimenti
- Adair, T. H. . Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray’s law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray’s law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. . Wheater’s functional histology: A text and colour atlas. , (2000).
- O’Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
- Elias, H. G. . An Introduction to Polymer Science. , (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D’Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human “angiogenesis” assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
