MicroRNA<em> सीटू</em> Formalin तय किडनी ऊतकों के लिए संकरण
Summary
यह लेख formalin तय गुर्दे वर्गों में microRNA अभिव्यक्ति की colormetric का पता लगाने के लिए अनुकूलित एक में सीटू संकरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
Abstract
इस लेख में हम microRNA जांच में चिह्नित digoxigenin साथ स्वस्थानी संकरण में के माध्यम से गुर्दे में miRNA के वर्णमिति का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन. मूल रूप से Kloosterman और Exiqon miRNA जांच 1 के साथ व्यापक इस्तेमाल के लिए उनके सहयोगियों द्वारा विकसित इस प्रोटोकॉल, गुर्दे के ऊतकों में miRNA विश्लेषण में निहित चुनौतियों पर काबू पाने के लिए संशोधित किया गया है. ये ऐसी संरचना की पहचान और अवशिष्ट जांच और एंटीबॉडी को दूर करने के लिए कड़ी के रूप में मुद्दों में शामिल हैं. अपेक्षाकृत पतली का प्रयोग, 5 मिमी मोटी, एक मजबूत जांच संकेत कोशिकाओं में बनाए रखा गया था, जबकि गुर्दे की संरचनाओं का स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति दी ऊतक वर्गों. इसके अतिरिक्त, जांच एकाग्रता और ऊष्मायन शर्तों कम पृष्ठभूमि और अविशिष्ट संकेत के साथ microRNA अभिव्यक्ति के दृश्य की सुविधा के लिए अनुकूलित थे. इधर, अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रक्रिया के अंत में स्लाइड्स के बढ़ते के माध्यम से प्रारंभिक ऊतक संग्रह और तैयारी को कवर, वर्णित है. बुनियादी घटकइस प्रोटोकॉल का एनटीएस अन्य ऊतकों और सेल संस्कृति मॉडल के लिए आवेदन के लिए बदला जा सकता है.
Introduction
MicroRNA endogenously उत्पादित कर रहे हैं कि RNAs noncoding (लगभग 22 nucleotides लंबे) छोटे हैं. वे आम तौर पर translational दमन या mRNA गिरावट के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबाने के लिए कार्य करते हैं. अधूरा पूरकता के साथ mRNA लक्ष्य को miRNAs बाँध, यह संभव है एक एकल miRNA कई लक्ष्यों को दबाने के लिए कर रही है.
सेल प्रकार और संरचनाओं miRNAs व्यक्त जो समझ तंत्र को समझने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, जिसके माध्यम से miRNA अभिव्यक्ति प्रभाव सेल और ऊतक phenotypes में परिवर्तन. ऐसे miRNA अनुक्रमण, qPCR और उत्तरी सोख्ता जैसे तरीकों पूरे ऊतकों में miRNAs का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण है कि वे एक दिया ऊतक के भीतर से आया है जो विशिष्ट सेल प्रकार निर्धारित करने की अनुमति नहीं है. इन तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण करने से पहले सेलुलर और संरचनात्मक घटकों के विच्छेदन बहुत मुश्किल हो सकता है और पर्याप्त isolations प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों अल करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंजीन अभिव्यक्ति या RNAs के गिरावट में terations. स्वस्थानी संकरण में microRNA ऊतकों में microRNA स्थान और अभिव्यक्ति के स्तर कल्पना करने की विधि है. इस तकनीक को गुर्दे के रूप में विषम संरचनाओं से बना ऊतकों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
MicroRNAs गुर्दा विकास 2,3 और फिजियोलॉजी 4 में एक नियामक भूमिका निभा दिखाया गया है. microRNA अभिव्यक्ति परिवर्तन भी ऐसे फाइब्रोसिस 5-10, मधुमेह अपवृक्कता 7, गुर्दे कार्सिनोमा 11,12, और तीव्र गुर्दे की चोट के रूप में 13 वृक्क विकृति के साथ शामिल होने के लिए दिखाया गया है. हमारे शोध में, हम गुर्दे के ऊतकों के लिए स्वस्थानी संकरण में microRNA के अनुकूलन स्वास्थ्य और रोग 14 दोनों में miRNA अभिव्यक्ति की सटीक संरचनात्मक स्थानों का निर्धारण करने के लिए मूल्यवान था कि मिल गया है. विभिन्न microRNAs के ट्यूबलर और सेलुलर अभिव्यक्ति का निर्धारण महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रादेशिक सेना की उनके विनियमनrgets सेलुलर कार्यों पर निर्भर हो सकता है. रोगग्रस्त राज्यों में यह miRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन समारोह को प्रभावित किया जा सकता है कि कैसे निर्धारित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.
यहाँ वर्णित विधि का लक्ष्य Kloosterman एट अल. 15, अन्य जांचकर्ताओं 16,17 द्वारा विकसित की मौजूदा ISH के तरीके पर निर्माण करने के लिए था, और उन Exiqon 1 ने सुझाव दिया है और formalin तय गुर्दे के ऊतकों के लिए विधि का अनुकूलन. हम सफलतापूर्वक एकतरफा ureteral बाधा 18 से गुर्दे microRNA मीर 382 अभिव्यक्ति में अलग क्षेत्रीय मतभेद की पहचान करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. इस दृष्टिकोण के अतिरिक्त अनुकूलन के साथ, साथ ही अन्य ऊतकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद के लक्ष्य formalin तय गुर्दे के ऊतकों में अच्छी तरह से काम करता है कि सीटू संकरण में miRNA के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए किया गया था. इस प्रोटोकॉल बाहर काम करते हुए धुंधला विरूपण साक?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया HL082798 और HL111580 अनुदान.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
Riferimenti
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
