Estudo das interacções de<em> Staphylococcus aureus</em> Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy

Summary

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de PSMs e outras toxinas segregadas por<em> Staphylococcus aureus</em> Em neutrófilos utilizando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

Abstract

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de modulins solúveis fenol (PSMs) e outras toxinas produzidas e secretadas por Staphylococcus aureus, nos neutrófilos. Para estudar os efeitos dos PSMs de neutrófilos nos isolar neutrófilos frescos utilizando centrifugação em gradiente de densidade. Estes neutrófilos são carregadas com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. A activação dos neutrófilos por PSMs inicia um aumento rápido e transitório na concentração de cálcio intracelular livre. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medida por monitorização da fluorescência de um corante pré-carregada, que reage com o aumento da concentração de ^{Ca2 +} livre. Usando esse método, podemos determinar a concentração PSM necessário para ativar os neutrófilos, e medir os efeitos de inibidores específicos e gerais da ativação de neutrófilos.

Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intracelular, we foram construídas fusões repórter do promotor do operão PSMα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus são fagocitados pelos neutrófilos, a indução da expressão pode ser observada por meio de microscopia de fluorescência.

Introduction

Os neutrófilos (PMN) são fagócitos profissionais que desempenham um papel chave na resposta imune inata contra Staphylococcus aureus ^1. A constante batalha entre o anfitrião eo micróbio levou a uma corrida armamentista de ambos. Recentemente, comunidade-associado (CA) das cepas de S. meticilina resistente aureus (MRSA) surgiram que parecem ser muito eficiente na neutralização de neutrófilos assassinato ^2,3. Modulin produção excessiva solúvel fenol (PSMs) de MRSA-CA foi associada a uma maior virulência ^4,5. Os neutrófilos humanos pode reconhecer estas PSMs através FPR2 que levam à activação deste acoplado à proteína G do receptor ^6. Um dos primeiros eventos é a mobilização das reservas intracelulares de cálcio ^{(Ca2 +).} Ca ^{2 +} actua como um mensageiro secundário para uma variedade de funções efectoras incluindo desgranulação de PMN e fagocitose ^7. Portanto ^{Ca2 +} é um indicador muito sensível dacapacidade funcional dos PSMs para ativar PMNs. Para estudar os efeitos dos PSMs para os neutrófilos, os neutrófilos são isolados frescos e carregado com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medido. Usando este método, é possível estudar os efeitos directos de componentes tóxicos e de outros para os neutrófilos, e determinar a concentração mais baixa à qual estes estão activas. Para nós, é uma ferramenta muito útil para estudar o efeito de muitas proteínas produzidas por S. aureus envolvidos na evasão imune, como FPR2 proteína inibidora (FLIPR) ^8, FLIPR-like ⁷ e Quimiotaxia proteína inibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Todas estas proteínas foram mostradas para inibir a mobilização de cálcio no número de neutrófilos por ligação ao receptor que reconhece o agonista.

Recentemente, o nosso grupo descrito que os PSMs estão funcionalmente inibida por lipoproteínas séricas ^{10 <}/ Sup>. Estas lipoproteínas estão abundantemente presentes no sangue e no tecido humano, o que indica que os PSMs exercer a sua função, principalmente no meio intracelular. A disponibilidade do ensaio de mobilização do cálcio nos permitiu medir com precisão o efeito de lipoproteínas do soro sobre a activação dos neutrófilos por os PSMs, indicado pela inibição considerável por concentrações muito baixas de soro.

Uma vez que os PSMs estão funcionalmente inibida por soro, a hipótese de que existe uma função importante para os PSMs como toxinas intracelulares. Por isso, procuraram determinar o papel de PSMs após a fagocitose. Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intercelular, construímos fusões repórter do promotor do operão psmα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus foram fagocitados pelos neutrófilos, indução de expressão foi observado por microscopia de fluorescência de ^10. Obviamente, esta technique permite o estudo da expressão de um grande número de genes em S. aureus ou outros agentes patogénicos depois de fagocitose. Uma vez que para S. aureus sobreviver no nicho intercelular é muito importante para superar o sistema imune inato ^{11 10 12,} estudando o papel dos genes ativados neste nicho é altamente relevante para a compreensão de sua virulência.

Protocol

1. Isolamento dos PMNs a partir de sangue humano por centrifugação de densidade Desenhe 5 9 tubos ml de sangue venoso heparinizado. Preparar gradientes de Ficoll dupla camada (4 gradientes para 5 tubos de sangue) do seguinte modo: 12 ml de Despeje a g / ml de solução de 1,119 densidade Ficoll num tubo de 50 ml e cuidadosamente camada de 10 ml de uma g / ml de solução de densidade Ficoll 1.077 no topo. Dilui-se o sangue com um volume igual de PBS. Camada do sangue diluído c…

Representative Results

Citometria de fluxo para análise da mobilização de cálcio em PMNs humanos A incubação de neutrófilos com uma série de concentração de PSMα3 sintéticos, resultando em activação rápida medida pelo fluxo de cálcio, o que é mostrado por um aumento no sinal em FL-1. Pré-incubação de PSMα3 sintético com 0,01%, 0,1% ou 1% de soro humano inibiu significativamente a capacidade de provocar fluxos de cálcio (Figura 1). Análise da expressã…

Discussion

Nos métodos aqui descritos alguns passos são muito crítico. Vamos destacar estes aqui.

Para o isolamento dos neutrófilos, por centrifugação em gradiente de densidade é importante para não perturbar as camadas, durante ou após os passos de centrifugação. Quando a aspiração dos neutrófilos utilizando uma pipeta de plástico, certifique-se de não apertar o balão, enquanto na camada de células, tal como ejectar líquido irá perturbar as camadas. Além disso, inspecione visualme…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process