L'étude des interactions de<em> Staphylococcus aureus</em> Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

Summary

Nous présentons les méthodes pour étudier l'effet du PSM et d'autres toxines sécrétées par<em> Staphylococcus aureus</em> Sur les neutrophiles en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence.

Abstract

Nous présentons les méthodes pour étudier l'effet de modulins solubles phénol (PSM) et d'autres toxines produites et sécrétées par Staphylococcus aureus sur les neutrophiles. Pour étudier les effets des MPS sur les neutrophiles nous isolons neutrophiles frais en utilisant un gradient de densité centrifugation. Ces neutrophiles sont chargées avec un colorant fluorescent qui lors de la mobilisation du calcium. L'activation des neutrophiles par les MSP lance une augmentation rapide et transitoire de la concentration de calcium intracellulaire libre. Dans une expérience de cytométrie en flux cette mobilisation rapide peut être mesurée en surveillant la fluorescence d'un colorant pré-chargé qui réagit à l'augmentation de la concentration de Ca ^{2 +} libre. En utilisant cette méthode, nous pouvons déterminer la concentration de PSM nécessaire d'activer le neutrophiles, et de mesurer les effets des inhibiteurs spécifiques et générales de l'activation des neutrophiles.

Pour étudier l'expression des MPS dans l'espace intracellulaire, we ont construit fusions rapporteurs du promoteur de l'opéron PSMα à la GFP. Lorsque ces souches rapporteuses de S. aureus sont phagocytés par les neutrophiles, l'induction de l'expression peut être observée en utilisant la microscopie à fluorescence.

Introduction

Neutrophiles (PMN) sont des phagocytes professionnels qui jouent un rôle clé dans la réponse immunitaire innée contre le Staphylococcus aureus ^1. La bataille constante entre l'hôte et microbe a conduit à une course aux armements des deux. Récemment, la communauté-associés souches (CA) de résistant à la méticilline S. aureus (MRSA) ont vu le jour qui semble être très efficace dans la neutralisation des neutrophiles meurtre ^2,3. Modulin (PSM), la production soluble phénol excessif de CA-MRSA a été associée avec une plus grande virulence ^4,5. Neutrophiles humains peuvent reconnaître ces PSM via FPR2 qui conduisent à l'activation de cette protéine-G récepteur couplé à ^6. Un des premiers événements est la mobilisation des réserves intracellulaires de calcium (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} agit comme un messager secondaire pour une variété de fonctions effectrices des PMN dont la dégranulation et la phagocytose ^7. Par conséquent Ca ^{2 +} est un indicateur très sensible de lala capacité fonctionnelle du PSM pour activer PMN. Pour étudier les effets de PSM sur les neutrophiles, les neutrophiles frais sont isolées et chargées avec un colorant fluorescent qui lors de la mobilisation du calcium. Dans une expérience de cytométrie en flux cette mobilisation rapide peut être mesurée. En utilisant cette méthode, il est possible d'étudier les effets directs des composants toxiques et d'autres sur les neutrophiles, et de déterminer la concentration minimale à laquelle ceux-ci sont actifs. Pour nous, c'est un outil très utile pour étudier l'effet de nombreuses protéines produites par S. aureus impliquée dans l'évasion immunitaire, comme FPR2 protéine inhibitrice (FlipR) ^8, FlipR-like ⁷ et Chemotaxis protéine inhibitrice de Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Toutes ces protéines ont été montré pour empêcher la mobilisation du calcium dans les neutrophiles en se liant au récepteur reconnaissant l'agoniste.

Récemment, notre groupe a indiqué que les MSP sont fonctionnellement inhibés par les lipoprotéines du sérum ^{10 <}/ Sup>. Ces lipoprotéines sont abondamment présents dans le sang et les tissus humains, ce qui indique que les MSP exercent leur fonction principalement dans le milieu intracellulaire. La disponibilité du test de mobilisation du calcium permis de mesurer précisément l'effet des lipoprotéines du sérum sur l'activation des neutrophiles par les PSM, indiquée par l'inhibition considérable par de très faibles concentrations de sérum.

Depuis les PSM sont fonctionnellement inhibée par le sérum, nous avons émis l'hypothèse qu'il existe une fonction importante pour PSM que les toxines intracellulaires. Nous avons donc cherché à déterminer le rôle de PSM après phagocytose. Pour étudier l'expression des MPS dans l'espace intercellulaire, nous avons construit des fusions rapporteurs du promoteur de l'opéron psmα à la GFP. Lorsque ces souches rapporteuses de S. aureus ont été phagocytés par les neutrophiles, l'induction de l'expression était observable en utilisant la microscopie à fluorescence ^10. Évidemment, cette technique permet l'étude de l'expression d'un grand nombre de gènes de S. aureus ou d'autres agents pathogènes après phagocytose. Étant donné que pour S. aureus survivre dans la niche intercellulaire est très important pour surmonter le système immunitaire inné ^{11 10 12,} étudier le rôle des gènes activés dans ce créneau est très pertinente pour la compréhension de sa virulence.

Protocol

1. Isolation des PMN du sang humain par centrifugation par densité Dessinez 5 9 tubes ml de sang veineux hépariné. Préparer double couche gradients Ficoll (4 gradients de 5 tubes de sang), comme suit: verser 12 ml d'une solution de ficoll de densité 1,119 g / ml dans un tube de 50 ml et la couche soigneusement 10 ml d'une solution de ficoll de densité 1,077 g / ml sur le dessus. Diluer le sang avec un volume égal de PBS. La couche de sang dilué avec soin sur la co…

Representative Results

Débit test de cytométrie pour l'évaluation de la mobilisation du calcium dans les PMN humains Incuber des neutrophiles avec une série de concentrations de PSMα3 synthétiques résultant en une activation rapide, tel que mesuré par le flux de calcium, qui est représenté par une augmentation du signal dans FL-1. La pré-incubation de synthèse PSMα3 avec 0,01%, 0,1% ou 1% de sérum humain inhibé de manière significative la capacité de susciter des flux de calcium (Figure 1…

Discussion

Dans les procédés décrits ici quelques étapes sont très critiques. Nous allons mettre en évidence ces ici.

Pour l'isolement des neutrophiles par centrifugation en gradient de densité, il est important de ne pas perturber les couches pendant ou après les étapes de centrifugation. Lors de l'aspiration des neutrophiles à l'aide d'une pipette en plastique, assurez-vous de ne pas presser le ballon alors que dans la couche de cellules, comme éjecter un liquide va perturb…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process