Оптический Обнаружение<em> Е. палочка</em> Бактерии по Мезопористые Silicon биосенсоров
Summary
Метка без оптического биосенсора для выявления быстрые бактерий вводится. Биосенсор на основе наноструктурированного пористого Si, которая предназначена для захвата непосредственно в клетки-мишени бактерий на его поверхности. Мы используем моноклональных антител, иммобилизованных на пористую преобразователя, как захвата зондов. Наши исследования показывают, применимость этих биосенсоров для обнаружения низких бактериальных концентрации в течение нескольких минут без предыдущего обработки образцов (например, лизиса клеток).
Abstract
Метка без оптического биосенсора на основе наноструктурированного пористого кремния предназначен для быстрого захвата и обнаружения кишечной палочки K12 бактерий, как модель микроорганизма. Биосенсор основан на прямое связывание клеток бактерий-мишеней на ее поверхности, в то время как не предварительной обработки (например, путем лизиса клеток) из исследуемого образца не требуется. Мезопористого Si тонкая пленка используется в качестве оптического элемента датчика биосенсора. Под освещении белым светом, пористый слой отображает хорошо решены Фабри-Перо картины полос в ее отражения спектра. Применение быстрого преобразования Фурье (FFT) с результатами данных об отражательной способности в одном пике. Изменения в интенсивности пика FFT контролируются. Таким образом, целевые бактерии захватить на поверхность биосенсора, через антиген-антитело взаимодействия, вызывает измеримые изменения в интенсивности БПФ пиков, что позволяет для «реального времени» наблюдения привязанности бактерий.
нт "> мезопористый фильм Si, сфабрикованы электрохимического процесса анодирования, сопряжена с моноклональных антител, специфичных для бактерий-мишеней. обездвиживание, immunoactivity и специфичность антител подтверждены люминесцентных экспериментов маркировки. После того, как биосенсор подвергается целевые бактерии, клетки непосредственно захвачен на антитела с модифицированной поверхностью пористого Si. Эти конкретные записи событий привести к изменениям интенсивности в интерференционной оптической тонкопленочной спектра биосенсора. Показано, что эти биосенсоры могут обнаружить концентрацию относительно низкие бактерий (обнаружение предел 10 4 клеток / мл) в менее чем за час.Introduction
Ранний и точная идентификация патогенных бактерий является чрезвычайно важным для безопасности пищевых продуктов и воды, экологический мониторинг, и точка-в-санитарной диагностики 1. Как традиционные методы микробиологии занимают много времени, трудоемкий, и не имеют способность обнаруживать микроорганизмы в "реальном времени" или вне лабораторных условиях, биосенсоры развиваются для решения этих задач 2-5.
В последние годы, пористый Si (PSI) возник как перспективной площадки для разработки датчиков и биосенсоров 6-20. За последние десять лет многочисленные исследования, касающиеся PSI на основе оптических датчиков и биосенсоров были опубликованы 21,22. Наноструктурированных PSi слой обычно изготавливают путем электрохимического анодного травления от монокристаллического пластины кремния. Полученные PSi наноматериалы проявляют многие выгодные характеристики, такие как большой поверхности и свободного объема, размеры пор, которыми можно управлять и перестраиваемый Optiческих свойств 10,16. Оптические свойства пси слоя, например, ФЛ 8,11 и белый свет отражения на основе интерферометрии 7,19, находятся под сильным влиянием условий окружающей среды. Захват гостевых молекул / целевых аналитов в пористом слоя приводит к изменению среднего показателя преломления пленки, наблюдаемого в качестве модуляции в спектре фотолюминесценции или в виде сдвига длины волны в спектре отражения 10.
Хотя подавляющее инновации в PSi технологии оптического биосенсора, есть только несколько сообщений о пси-платформ для обнаружения бактерий 6,8,20,23-29. Кроме того, большинство из этих доказательств правильности концепции исследований продемонстрировали "косвенное" обнаружение бактерий. Таким образом, как правило, до лизиса клеток требуется для извлечения целевых фрагментов белка / ДНК, характерные для исследованных бактерий 29. Наш подход заключается в непосредственно захватить целевые бактерииклетки на PSi биосенсора. Таким образом, моноклональные антитела, которые являются специфическими для целевой бактерии, обездвижены на пористой поверхности. Связывание бактериальных клеток, с помощью антиген-антитело взаимодействий, на поверхность биосенсора вызывать изменения амплитуды (интенсивность) отражательной спектра 24-26.
В этой работе мы сообщаем о строительстве оптического PSi основе биосенсора и продемонстрировать свое применение в качестве метки без биодатчиков платформы для обнаружения кишечной палочки (E.coli) K12 бактерии (используемые в качестве модельного микроорганизма). Мониторинг оптический сигнал свет, отраженный от пси наноструктуры из-за Фабри-Перо тонкопленочного помех (рис. 1А). Изменения в светло-амплитудной / интенсивности коррелируют с определенной иммобилизации клеток бактерий-мишеней на поверхность биосенсора, что позволяет для быстрого обнаружения и определения количества бактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метка свободного оптического иммуносенсор, на основе PSIO 2 наноструктуры (тонкая пленка Фабри-Перо) изготовлен, и его потенциал применимость в качестве биосенсора для обнаружения бактерий подтверждается.
Изменения и устранение неисправностей
Одна и?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Израильской научного фонда (грант № 1118/08 и грант № 1146/12) и Kroll исследовательского фонда Минна Мемориал. ES выражает благодарность за финансовую поддержку Рассела Berrie нанотехнологий института.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
Riferimenti
- Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
- Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
- Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
- Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
- Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
- Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
- Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
- Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
- Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
- D’Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys – Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
- de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
- Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
- Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
- Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
- Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
- Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
- Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
- Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
- Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
- Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
- Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
- Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
- Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
- Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via “Direct Cell Capture”. Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
- Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
- Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
- Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
- Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
- Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
- Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
- Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
- Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
- Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
- Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).
