Optische detectie van<em> E. coli</em> Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren
Summary
A-label-free optische biosensor voor de snelle detectie van bacteriën wordt geïntroduceerd. De biosensor is gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si, die is ontworpen om direct vastleggen van de doelbacteriën cellen op het oppervlak. Wij gebruiken monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd op de poreuze transducer als capture probes. Onze studies tonen de toepasselijkheid van deze biosensoren voor de detectie van lage bacteriële concentraties binnen enkele minuten zonder voorafgaande monster verwerking (zoals mobiele lysis).
Abstract
A-label-free optische biosensor gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si is ontworpen voor een snelle capture en detectie van Escherichia coli K12 bacteriën, als model micro-organisme. De biosensor gebaseerd op directe binding van de doelbacteriën cellen op het oppervlak, terwijl er geen voorbehandeling (bijvoorbeeld door cellysis) van de onderzochte steekproef is vereist. Een mesoporeuze Si dunne film wordt gebruikt als de optische omzetter onderdeel van de biosensor. Onder wit licht verlichting, de poreuze laag geeft goed opgelost Fabry-Perot franje patronen in de reflectiviteit spectrum. Toepassing van een snelle Fourier transformatie (FFT) om reflectievermogengegevens resulteert in een enkele piek. Veranderingen in de intensiteit van de FFT piek bewaakt. Aldus doelbacteriën vangen op de biosensor oppervlak, door middel van antilichaam-antigen interacties induceert meetbare veranderingen in de intensiteit van de FFT pieken, waardoor een 'real time' observatie bacteriën bevestiging.
nt '> De mesoporeuze Si film, vervaardigd door een elektrochemische anodisatie proces wordt geconjugeerd met monoklonale antilichamen specifiek voor de doelbacteriën. de immobilisatie, immunoactiviteit en specificiteit van de antilichamen worden bevestigd door fluorescentie labeling experimenten. Nadat de biosensor is blootgesteld aan de doelbacteriën, worden de cellen direct gevangen op het antilichaam gemodificeerde poreuze Si oppervlak. Deze specifieke vastleggen van gebeurtenissen resulteren in intensiteit veranderingen in de dunne-film optische interferentie spectrum van de biosensor. We tonen aan dat deze biosensoren relatief lage concentraties kan detecteren bacteriën (detectie maximaal aantal 10 4 cellen / ml) in minder dan een uur.Introduction
Vroege en nauwkeurige identificatie van pathogene bacteriën is van groot belang voor de veiligheid van voedsel en water, milieu-monitoring, en point-of-care diagnostiek 1. Als traditionele microbiologie technieken zijn tijdrovend, arbeidsintensief, en niet de mogelijkheid om micro-organismen te detecteren in "real-time" of buiten het laboratorium omgeving worden biosensoren evolueren om deze uitdagingen 2-5 te voldoen.
In de afgelopen jaren, poreus Si (PSI) is ontstaan als een veelbelovend platform voor het ontwerpen van sensoren en biosensoren 6-20. De afgelopen tien jaar tal van studies met betrekking tot overheidsinformatie gebaseerde optische sensoren en biosensoren werden gepubliceerd 21,22. De nanogestructureerde pSi laag wordt meestal vervaardigd door elektrochemische anodische ets van een monokristallijn Si wafer. De resulterende PSI nanomaterialen vertonen vele voordelige kenmerken, zoals grote oppervlak en vrij volume, poriegrootten die worden gecontroleerd en afstembare optimaalcal eigenschappen 10,16. De optische eigenschappen van de PSI-laag, zoals fotoluminescentie 8,11 en wit licht-reflectie gebaseerde interferometrie 7,19, worden sterk beïnvloed door omgevingsfactoren. Vangst van gasmoleculen / doelanalyten binnen de poreuze laag resulteert in een verandering van de gemiddelde brekingsindex van de film, waargenomen als een modulatie in het fotoluminescentiespectrum of golflengteverschuiving in de reflectie spectrum 10.
Hoewel de overgrote innovatie in pSi optische biosensor technologie, zijn er slechts enkele meldingen op overheidsinformatie gebaseerde platforms voor bacteriën detectie 6,8,20,23-29. Bovendien zijn de meeste van deze proof-of-concept studies hebben "indirecte" bacteriën die aangetoond. Aldus wordt meestal vooraf lysis van de cellen nodig is om de beoogde eiwit / DNA-fragmenten, kenmerkend voor de bestudeerde bacteriën 29 extraheren. Onze aanpak is om de doelbacteriën direct vast te leggencellen op de PSI-biosensor. Daarom zijn monoklonale antilichamen die specifiek voor bacteriën richten zijn geïmmobiliseerd op het poreuze oppervlak. Binding van bacteriecellen via antilichaam-antigen interacties op het oppervlak van de biosensor veranderingen in de amplitude (intensiteit) van de reflectiviteit spectrum 24-26 induceren.
In dit werk, doen we verslag van de bouw van een optische overheidsinformatie gebaseerde biosensor en demonstreren de toepassing ervan als een label-vrije biosensoren platform voor de detectie van Escherichia coli (E. coli) K12 bacteriën (als model micro-organisme). De bewaakte optisch signaal is het licht dat weerkaatst wordt door de PSI-nanostructuur gevolg van Fabry-Perot dunne film interferentie (Figuur 1A). Veranderingen in het licht amplitude / intensiteit gecorreleerd aan specifieke immobilisatie van het doel bacteriecellen op de biosensor oppervlak, waardoor een snelle detectie en kwantificering van de bacteriën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een label-vrije optische immunosensor, gebaseerd op een PSiO 2 nanostructuur (a Fabry-Perot dunne film) wordt vervaardigd, en de mogelijke toepasbaarheid als biosensor bacteriën detectie bevestigd.
Wijzigingen en probleemoplossing
Een van de grootste problemen bij het ontwerpen van een immunosensor is de gevoeligheid van antilichamen tegen ongewenste conformatie veranderingen ondergaan tijdens de depositie en patroonvorming op het vaste substraat, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 1118-1108 en subsidie nr. 1146/12) en de Minna Kroll Fonds Memorial Research. ES zeer erkentelijk voor de financiële steun van de Russell Berrie Nanotechnologie Instituut.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
Riferimenti
- Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
- Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
- Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
- Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
- Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
- Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
- Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
- Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
- Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
- D’Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys – Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
- de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
- Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
- Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
- Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
- Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
- Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
- Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
- Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
- Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
- Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
- Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
- Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
- Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
- Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via “Direct Cell Capture”. Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
- Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
- Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
- Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
- Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
- Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
- Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
- Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
- Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
- Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
- Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).
