Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell
Summary
Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.
Abstract
Muitos vírus RNA evoluíram a capacidade para inibir a transcrição da célula hospedeira como um meio para contornar as defesas celulares. Para o estudo destes vírus, é, por conseguinte, é importante ter uma forma rápida e fiável de medir a actividade de transcrição em células infectadas. Tradicionalmente, a transcrição foi medida quer por incorporação de nucleótidos radioactivos tais como 3 H-uridina seguido por detecção através de autoradiograf ia ou contagem de cintilações, ou incorporação de análogos de uridina derivados halogenados tais como 5-bromouridine (BRU), seguido por detecção por imunocoloração. O uso de isótopos radioactivos, no entanto, exige equipamento especializado e não é viável em um certo número de configurações de laboratório, ao passo que a detecção de BrU pode ser complicado e pode sofrer de uma baixa sensibilidade.
A química clique recentemente desenvolvidos, o que envolve uma formação de triazole catalisada por cobre a partir de uma azida e um alcino, proporciona agora uma rápida e highly alternativa sensíveis a estes dois métodos. Instruções química é um processo de dois passos em que ARN nascentes é rotulado pela primeira vez por incorporação do análogo de uridina 5-etiniluridina (UE), seguido de detecção do rótulo com uma azida fluorescente. Estas azidas estão disponíveis como vários fluoróforos diferentes, permitindo uma grande variedade de opções para visualização.
Este protocolo descreve um método para medir a supressão de transcrição em células infectadas com o vírus da febre de Rift Valley (RVFV) estirpe MP-12, utilizando química do clique. Ao mesmo tempo, a expressão de proteínas virais nestas células é determinada por imunocoloração intracelular clássica. Etapas de 1 a 4 detalhar um método para visualizar supressão transcricional via microscopia de fluorescência, enquanto os passos 5 a 8 pormenor um método para quantificar a supressão da transcrição via citometria de fluxo. Este protocolo é facilmente adaptável para utilização com outros vírus.
Introduction
Tradicionalmente, a actividade de transcrição foi medida através da incorporação de qualquer radioactivos (3 H-uridina) 1 ou halogenados (BRU) em dois nucleósidos de ARN nascentes. Estes análogos de uridina são absorvidos pelas células, convertida em uridina-trifosfato (UTP), através da via de recuperação de nucleósido, e subsequentemente incorporada no ARN recém-sintetizado. 3H-uridina pode ser detectada por auto-radiografia, o que pode ser demorado, ou cintilação de contagem, o que requer equipamento especializado. Além disso, a utilização de isótopos radioactivos podem não ser prático em um certo número de configurações de laboratório, incluindo os de alta laboratórios biossegurança contenção. BrU pode ser detectada através de coloração imunológica com anticorpos anti-Bru, que podem exigir a permeabilização duras para garantir o acesso do anticorpo ao núcleo parcial ou desnaturação do ARN, com a estrutura secundária do ARN pode ser um impedimento estereoquímico à ligação de anticorpos.
_content "> O protocolo aqui descrito utiliza a recentemente desenvolvida clique química 3 para medir a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12. Instruções química baseia-se num cobre altamente selectivo e eficiente (I) catalisada por reacção de cicloadição entre um e alcino uma porção de azida de 4,5. Neste protocolo, o ARN nascentes em células infectadas é rotulado pela primeira vez através da incorporação de uridina analógico UE. Num segundo passo, o UE incorporado é detectado por meio de reacção com um azeto fluorescente. As principais vantagens deste método são (1) que não requerem a utilização de isótopos radioactivos e (2), que não requer a permeabilização dura ou desnaturação do ARN. Com um peso molecular de menos de 50 Da, o acesso da azida fluorescente não é impedida por insuficiente estrutura secundária permeabilização ou RNA. Além disso, os pesquisadores não estão limitadas na sua escolha de anticorpos primários ao combinar a detecção de ARN com uma classeimmunostaining iCal para proteínas virais.Dois métodos diferentes são descritas neste protocolo: uma para a visualização de transcrição através de microscopia de fluorescência (passos 1-4), e uma para quantificar a transcrição através de citometria de fluxo (passos 5-8). Ambos os métodos combinam rotulagem de ARN nascentes com uma imunocoloração intracelular para as proteínas virais, o que permite estabelecer uma correlação entre a actividade de transcrição e infecção viral numa base célula-por-célula.
Os autores usaram com sucesso o protocolo aqui descrito para determinar a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12 6, as células infectadas com diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, e as células infectadas com o vírus da Toscana (TOSV) 10. O protocolo aqui descrito pode ser facilmente adaptado para ser utilizado com vírus diferentes e tem o potencial de ser modificado para incluir a coloração por imunofluorescência de proteínas virais ou celulares específicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo fornecido descreve um método para medir o efeito da infecção virai em transcrição da célula hospedeira através da incorporação do análogo de uridina UE em ARN nascentes. Este método possui várias vantagens sobre os métodos anteriores: é rápido, sensível e que não contam com a utilização de isótopos radioactivos. Além disso, o método pode ser adaptado para se obter dados qualitativos através de microscopia de fluorescência ou de dados quantitativos através de citometria de fluxo, util…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos RB Tesh para fornecer o mouse policlonal anti-RVFV soro e M. Griffin da UTMB Citometria de Fluxo Núcleo Facilidade para obter ajuda com citometria de fluxo. Este trabalho foi apoiado por cinco U54 AI057156 através do Centro Regional de Excelência Ocidental, NIH concessão R01 AI08764301 e financiamento do Centro de Sealy de Desenvolvimento de Vacinas no UTMB.BK foi apoiado pelo Fundo de W. James McLaughlin Fellowship em UTMB.OL foi apoiado por R. Hilleman Early-Stage Investigator Award Carreira Maurice.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
Riferimenti
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
