Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК
Summary
Этот метод описывает использование мыши химии для измерения изменений в принимающих транскрипции клетки после заражения лихорадкой Рифт-Валли Вирус (RVFV) штамма MP-12. Результаты могут быть визуализированы качественно с помощью флуоресцентной микроскопии или получают с количественным выходом путем проточной цитометрии. Этот способ можно приспособить для использования с другими вирусами.
Abstract
Многие вирусы РНК эволюционировали способность ингибировать транскрипцию клетку-хозяина, как средство, чтобы обойти сотовой оборону. Для изучения этих вирусов, поэтому важно, чтобы иметь быстрый и надежный способ измерения транскрипционной активности в инфицированных клетках. Традиционно транскрипции был измерен либо по включению радиоактивной нуклеозиды, такие как 3 H-уридина с последующим детектированием с помощью авторадиографии или сцинтилляционного счетчика или включение галогенированные аналоги уридина, такие как 5-bromouridine (BRU) с последующим детектированием с помощью иммунной окраски. Использование радиоактивных изотопов, однако, требует специального оборудования и не представляется возможным в ряде лабораторных условиях, в то время обнаружения BRU может быть громоздкими и могут страдать от низкой чувствительности.
Недавно разработанный мыши химии, который включает в себя медь катализируемой триазола образование из азида и алкина, теперь обеспечивает быстрое и Highlу чувствительных альтернативы этих двух методов. Нажмите химии является двухстадийным процессом, в котором возникающий РНК первый помечены путем включения уридина аналоговый 5-ethynyluridine (ЕС), с последующим детектированием этикетку с флуоресцентным азидом. Эти азиды доступны в нескольких различных флуорофоров, что обеспечивает широкий спектр возможностей для визуализации.
Этот протокол описывает метод измерения транскрипционные подавления в клетках, инфицированных лихорадкой Рифт-Валли Вирус (RVFV) штамма MP-12 с использованием клик химии. Одновременно экспрессии вирусных белков в этих клетках определяется классической внутриклеточный иммунной окраски. Шаги с 1 по 4 подробно метод визуализации транскрипционный подавление с помощью флуоресцентной микроскопии, а шаги с 5 по 8 подробно метод количественного транскрипционный подавление с помощью проточной цитометрии. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования с другими вирусами.
Introduction
Традиционно транскрипционную активность была измерена посредством включения или радиоактивный (3 H-уридина) один или галогенированных (BRU) 2 нуклеозидов в возникающий РНК. Эти аналоги уридина принимаются к клеткам, превращается в уридин-трифосфата (UTP) через нуклеозидов путь спасения, и впоследствии включено во вновь синтезированную РНК. 3 H-уридина может быть обнаружен с помощью авторадиографии, которые могут быть трудоемким или сцинтилляционного считая, что требует специального оборудования. Кроме того, использование радиоактивных изотопов не может быть практически в ряде лабораторных условиях, в том числе высокой сдерживания биобезопасности лабораторий. BRU могут быть обнаружены с помощью иммунных анти-BRU антител, которые могут потребовать суровых проницаемости для обеспечения доступа антитела к ядру или частичной денатурации РНК, а вторичной структуры РНК может быть стерических затруднений для связывания антител.
_content "> протокол, описанный здесь использует недавно разработанные нажмите химии 3 для измерения транскрипционной активности в клетках, инфицированных штаммом RVFV MP-12. Нажмите химии опирается на высокой селективностью и эффективное меди (I), катализируемой реакции циклоприсоединения между алкина и азид фрагмент 4,5. В этом протоколе, возникающий РНК в инфицированных клетках сначала помечены посредством включения уридина аналоговый ЕС. На втором этапе, объединенный ЕС обнаружены с помощью реакции с флуоресцентным азидом. Основным преимуществом этого метода являются (1), что она не требует использования радиоактивных изотопов и (2) что он не требует суровых проницаемости или денатурации РНК. с молекулярной массой менее 50 Da, доступ флуоресцентного азида не мешают недостаточный проницаемости или вторичной структуры РНК. Кроме того, исследователи не ограничены в своем выборе первичных антител при объединении обнаружения РНК с классомческих иммуноокрашивания для вирусных белков.Две различные методы описаны в данном протоколе: один для визуализации с помощью транскрипции флуоресцентной микроскопии (шаги 1-4) и один для количественного транскрипция проточной цитометрии (шаги 5-8). Оба этих метода сочетают маркировки растущих РНК с внутриклеточным иммуногистохимическое вирусных белков, что обеспечивает корреляцию между транскрипционной активности и вирусной инфекции на ячейку за ячейкой основе.
Авторы успешно использовали протокол, описанный здесь, чтобы определить транскрипционной активности в клетках, инфицированных штаммом RVFV MP-12 6 клеток, инфицированных различными MP-12 мутанты 7,8, 9 и клетки, инфицированные вирусом Toscana (TOSV) 10. Протокол, описанный здесь, может быть легко адаптирован для использования с различными вирусами и имеет потенциал, чтобы быть модифицирован, чтобы включать иммунофлуоресценции окрашивание специфических вирусных или клеточных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предоставляется протокол описывает метод для оценки влияния вирусной инфекции на хост транскрипции клетки через включение уридином аналоговых ЕС в зарождающейся РНК. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с предыдущими способами: это быстрый, чувствительный, и он не опирается…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим RB Tesh за предоставление мыши поликлональных анти-RVFV антисыворотки и М. Гриффин UTMB проточной цитометрии средство сердечника за помощью проточной цитометрии. Эта работа была поддержана на 5 U54 AI057156 через западный региональный центр повышения квалификации, грант NIH R01 AI08764301, и финансирование из Сили Центра разработки вакцин на UTMB.BK была поддержана Джеймс У. Маклафлин Фонд стипендий на UTMB.OL была поддержана на Мориса Р. Hilleman на ранних этапах карьеры Награды Исследователя.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
Riferimenti
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
