Lievito luminometrici e Xenopus ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

Sommario

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca ^{2 +} luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

Abstract

TRPV4 (Transient Receptor Potenziali, famiglia vanilloid, tipo 4) è ampiamente espressa nei tessuti vertebrati ed è attivato da diversi stimoli, tra cui da forze meccaniche. Alcune mutazioni TRPV4 causano complesso osso ereditaria o patologie neuronali umano. Wild-type o mutante TRPV4 transgeni sono comunemente espresse in cellule di mammifero in coltura ed esaminati dalla Fura-2 fluorometria e da elettrodi. In termini di meccanismo mechanosensitivity e le basi molecolari delle malattie, la letteratura attuale è confusa e controversa. Per completare metodi esistenti, si descrivono due metodi aggiuntivi per esaminare le proprietà molecolari di TRPV4. (1) Rat TRPV4 e un transgene aequorina si trasformano in lievito in erba. Uno shock ipo-osmtic della popolazione trasformante produce un segnale luminometrici causa della combinazione di equorina con Ca ^{2 +,} rilasciato attraverso il canale TRPV4. Qui TRPV4 è isolato dai suoi abituali partner di proteine ​​di mammiferie rivela la propria mechanosensitivity. (2) cRNA di TRPV4 viene iniettato in oociti di Xenopus. Dopo un adeguato periodo di incubazione, la corrente TRPV4 macroscopico viene esaminato con un morsetto di tensione a due elettrodi. L'attuale aumento dopo la rimozione di osmoticum inerti dal bagno ovocita è indicativo di mechanosensitivity. I microampere (10 ^-6 a 10 ^-4 A) correnti da ovociti sono molto più grandi rispetto alle subnano-to nA (10 ^-10 a 10 ^-9 A) correnti da cellule in coltura, producendo quantificazioni più chiare e valutazioni più sicuri. Correnti microscopiche che riflettono le attività delle proteine ​​dei singoli canali possono anche essere direttamente registrati sotto una patch clamp, in on-cella o in modalità asportato. Lo stesso ovocita fornisce più campioni di patch, consentendo la replica dei dati migliori. Aspirazioni applicate le patch possono attivare TRPV4 per valutare direttamente mechanosensitivity. Tali metodi dovrebbero anche essere utile nello studio di altri tipi di canali TRP.

Introduzione

TRP (potenziali recettori transitori) comprendono sette sottofamiglie di canali di comunicazione che servono funzioni sensoriali ^1,2. Nei mammiferi, TRPV, sottofamiglia vanilloid del TRP, ha sei varietà. TRPV4 (tipo 4) ^3,4 risponde al calore, alcune sostanze chimiche, gonfiore osmotico, o shear stress. Il gene TRPV4 stato ripetutamente isolato mediante candidato-gene e / o espressione clonazione ^5-8. Quest'ultimo metodo seguito la risposta del prodotto genico di ipo-osmolarità. TRPV4 è espresso in quasi tutti gli organi e le funzioni per lo sviluppo, fisiologia, patologia o di molti tipi di cellule disparate ^3,4.

Protocollo

1. Metodi di lievito luminometria

Utilizzare ceppo BYYT di Saccharomyces cerevisiae. Si tratta di un yvc1-tok1-derivato di BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Trasformare cellule con i-equorina esprimendo pEVP1/Aeq plasmide Leu-selezionabili e ura selezionabili rat--TRPV4 esprimendo plasmide p416GPDV4, come descritto in Batiza et al. ²⁶ e Loukin et al. ^{24 Con} metodi standard di costruzione plasmide e trasformazione ²⁷ . Ceppo di lievito e plasmidi sono disponibili su richiesta.

1. Cultura 2 ml di....

Risultati

In un tipico esperimento luminometria, una serie di 400-1,200 mOsm shock ipotonici non si raggiunge con l'aggiunta di 200 ml di soluzione d'urto di diversa bassa osmolarità a 20 ml di cultura a 1.400 mOsm. L'attività TRPV4 è evidente quando il RLU della disposizione sperimentale è confrontata con quella di due controlli negativi: cellule di lievito trasformate con il plasmide p416GPDV4 vuoto o uno che contiene il gene TRPV4 con una mutazione nel filtro di ioni (Figura 1) ^24.

Discussione

Come indicato nella Premessa, i metodi comunemente usati per studiare le funzioni TRPV4 talvolta portato a incongruenze e controversie. Le due serie di metodi qui descritti offrono alcuni vantaggi e possono integrare i metodi esistenti. Mentre si descrivono solo gli studi sulla TRPV4, i metodi possono essere estesi a studiare altri canali ionici pure.

1. Metodi di lievito luminometria

Lievito in erba ha un nativo di Ca ^{2 +-risposta} afflusso allo shock ip.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Osmometro a pressione di vapore	Wescor Wescor	5500	Logan, UT, USA
Luminometro a tubo singolo Sirius	Titertek-Berhold		Sirius Huntsville, LA, USA
Luminometro per micropiastre	Titertek-Berthold	Mithras LB940	Huntsville, LA, USA
Software di luminometria	Titertek-Berthold	MikroWin2000	Huntsville, LA, USA
Patch clamp e software	Axon Instrument	HS2A headstage, VG-2Ax100 morsetto per vasca virtuale con messa a terra, amplificatore GeneClamp 500, digitalizzatore digidata 1440, software pClamp10	Union City, CA, USA
Manometro	Bio-Tec		Winooski, VT, USA
Estrattore di pipette	Sutter Instrument Co	Modello P-97	Novata, CA, USA
Microiniettore	Drummond Scientific	Nanoinject II	Broomall, PA, USA
Luciferina celterazina	Invitrogen		Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polimerasi reazione	Ambion	mMessage mMachine	Austin, TX, USA
Gentamicin	Sigma
Rosso rutenio	Sigma
Micropipette	Pipette Drummond	da 100 microlitri	Broomall, PA, USA
PfuUtra polimerasi ad alta fedeltà	Stratagene		La Jolla, CA, Stati Uniti