Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석
Summary
세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 – 반응 분석 및 시간 – 중 – 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.
Abstract
BTV에 대한 잠재적 인 항 바이러스제를 확인하기 위해, 우리는 개발, 최적화 및 여기에 제시된 세 가지 분석을 확인했다. CPE 기반의 분석은 화합물은 항 바이러스 효능을 보여 큰 화합물 라이브러리를 화면으로 사용되었는지 여부를 평가하기 위해 개발 된 최초의 분석이었다. 한편, 항 바이러스의 세포 독성은 CPE 기반 분석을 사용하여 평가 될 수있다. 용량 – 반응 분석을 선택된 바이러스에 대한 효능의 범위를 결정하기 위해 디자인 된, 50 % 억제 농도 (IC 50)이나 유효 농도 (EC 50)뿐만 아니라 세포 독성의 범위 (CC 50) 즉. 토아 분석은 BTV 바이러스 라이프 사이클 또는 호스트 세포 기계에 대한 가능한 영향 동안 새로운 항 바이러스제의 기본 메커니즘을 결정하는 최초의 대학교 미술관의 연구에 사용 하였다. 이러한 분석은 세포 배양 시스템의 항 바이러스 효능을 평가하는데 매우 중요합니다, 우리의 최근의 연구지도를 위해 사용되어왔다BTV에 대한 새로운 항 바이러스제의 숫자의 식별을 보내고.
Introduction
BTV는 속 Orbivirus, 가족 Reoviridae에 프로토 타입 이중 가닥 RNA 바이러스이다. BTV는 세계 1,2 30억달러 / 년 손실, 양, 염소, 소와 다른 가축 등 국내 가축의 가장 중요한 질병 중 하나입니다. 이국적인 BTV의 혈청 형에 나열된 중요한 동물 병원체는 "USDA 높은 위험성 평가 가축 병원체." 최근 다시 부상 BTV의 북부 유럽 3,4에 걸쳐 여러 국가의 주요 가축 질병의 발생과 양을 발생했습니다. 경제적으로 중요한 결과 및 모델 시스템으로서, BTV는 유용한, 분자 유전 학적 및 구조적 연구의 대상이되어 왔으며, 몇몇 백신이 개발되었다. 그러나, 항 바이러스 약물 발견을위한 적합한 분석법의 부족 때문에, BTV 대에는 항 바이러스제는 없다.
모델 시스템으로 BTV를 사용하여 최근의 높은 처리량 검사 (HTS) 캠페인, 우리는 거라고, eveloped 최적화 아르보 바이러스 5에 대한 잠재적 인 광범위한 스펙트럼 항 바이러스를 식별 할 수있는 CPE 기반의 분석을 확인. CPE 기반의 분석은 신속하고 관찰 할 수있는 CPE / 세포 사멸 5-7을 유발 바이러스의 숫자에 대한 항 바이러스 약물 발견에 사용 된 잘 인식 분석이다. 우리의 시스템에서, 포스트 BTV 감염, CPE는 헬라, BSR 및 HEK 293T 8을 포함한 척추 동물의 세포에 분명하다. BTV 유도 CPE는 CellTiter 글로 세포 생존 시약 키트 (CTG 키트) 9를 포함한 다양한 세포 생존 검출 방법을 사용하여 모니터링하고 정량화 할 수있다. 이 키트는 대사 적으로 활성 살아있는 세포의 존재를 신호 셀룰러 ATP의 정량에 기초 문화 가능한 세포의 개수 표시를 결정한다. 최적의 조건에서, 여기에 제시된 CPE 기반의 분석은 "혼합 및 측정"한 단계 프로토콜 및 안정 발광 신호와 유연성의 가능성을 보여 주었다. 한편, 독성 화합물의 redu세포 생존 능력을의 cing은이 CPE 기반 분석에서 제외됩니다. CPE 기반의 분석은 그 견고성과 BTV에 대한 항 바이러스 약물 발견을위한 신뢰성을 보여 잠재적 인 항 바이러스 리드 화합물 (들 여섯 새로운 클러스터의 식별에지도하는 NIH 분자 도서관 작은 분자 저장소 (MLSMR)를 화면에 사용 된 ) 5.
잠재적 인 항 바이러스 화합물을 CPE 기반 분석을 사용하여 확인 된 경우는 항 바이러스 효능 및 독성 2의 범위를 결정하기 위하여 열 – 농도 용량 – 반응 분석을 실시 할 필요가있을 것이다. 항 바이러스 효능은 50 % 억제 농도 (IC 50) 또는 50 % 유효 농도 (EC 50)로 표현,베이스 라인과 최대 사이에 바이러스에 의한 CPE 반 억제하는 약물의 농도이다. 항 바이러스제의 세포 독성은, 50 %의 세포 독성 농도 (CC 50) 즉, 농도는기준선과 최대 사이의 50 % 세포 독성을 유발하는 약물. 50 % SI (SI 50)로 표시 선택적 지수 (SI)는 바이러스에 의한 CPE에 대한 항 바이러스의 특이성을 결정 CC 50 / IC (50)로부터 계산된다. IC 50 (또는 EC 50), CC (50)와 SI (50) 값은 항 바이러스 화합물은 강력하고 더 약물 개발을위한 선택 여부를 확인하는 중요한 조치이다.
항 바이러스가 시험 관내에서 어떠한 명백한 독성을 나타내지 않았다 아직 방지 바이러스 CPE 및 생산성 바이러스 라이프 사이클을 유도 할 때, 그 2 대학교 미술관을 특성화하는 것이 중요하다. 우리는 바이러스에 의해 영향 바이러스 라이프 사이클의 수 단계 (들)를 결정하기 위하여 토아 분석을 수행하여 그러한 특성을 개시. 일반적으로, 항 바이러스 화합물을 상이한 시간 전 또는 후 바이러스 감염시 세포에 첨가 하였다. 항 바이러스가 감염된 세포에 추가 된 경우 그 대상들에 게시이전 단계에 첨가 한 비교하여 TEP 감염 과정 동안, 그것은 낮은 활성을 초래할 것이다. 따라서, 토아 연구는 하나의 바이러스 라이프 사이클 또는 바이러스 성 수명주기에 관여 호스트 기계에, 화합물의 항 바이러스 효능, 그것의 잠재적 인 대상을 결정하는 것이 중요합니다.
세 가지 분석법을 위해, 세포 생존율은 제조업체의 지시에 5 다음 CTG 키트를 사용하여 측정 하였다. 이 검출 시스템은 다양한 내부 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수있는 적절한 발광 신호를 출력한다. 각각의 분석은 적어도 8 개의 복제본이 중으로 확인 및 수행 하였다. 모든 콘텐츠 데이터의 경우, 평균값 (AVE), 표준 편차 (STDEV) 및 공동 효율적인 변동 (CV) 등 세 가지 파라미터는, 분석의 견고성을 결정하기 위해 분석 하였다. 분석의 견고성이 결정되면, 데이터가 더 분석하고 다양한 biostatics 및 graphi를 이용하여 나타내 어질 것이다C 공구 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스 히트 초기 식별, 항 바이러스 약물 발견과 개발을위한 중요한 단계 중 하나는, 정량 가능한 마커를 선택하는 간단한 프로토콜을 개발, 충분한 신호와 10 % 미만의 CV를 획득 포함하는 견고한 분석법을 개발하는 것이다. 대부분의 생화학 적 또는 세포 – 기반 화면 인해 선별 과정에서 필요한 재현성 및 스크리닝하는 분자의 잠재적으로 많은 수의 가장 강력한, 간단하고 저렴한 분석, 기초 화…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 보조금 1R03MH08127-01와 NIH에서 Q. 리튬에 7R03MH08127-02에서 지원하고, UAB에서 의학 교실에서 충격의 펀드 Q. 리 하였다. Molette 기금 오번 대학에서 지원을 받고있다. 우리는 또한 작업 과정에서 양 Pulin 최 씨 블라디미르 Musiienko의 기술 조교 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
Riferimenti
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