Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus
Summary
Tres ensayos, incluyendo el efecto citopático (CPE) a base de ensayo, ensayo de dosis-respuesta y (TOA) ensayo de tiempo-de-Adición se han desarrollado, optimizado, validado y utilizado para identificar nuevos antivirales contra el virus de la lengua azul (BTV), así como para determinar el posible mecanismo de acción-de-(Ministerio de Agricultura) de antivirales recientemente identificados.
Abstract
Identificar potenciales antivirales contra BTV, hemos desarrollado, optimizado y validado tres ensayos que aquí se presentan. El ensayo basado en CPE fue el primer ensayo desarrollado para evaluar si un compuesto mostró ninguna eficacia antiviral y se han utilizado para cribar gran biblioteca de compuestos. Mientras tanto, la citotoxicidad de los antivíricos también podría ser evaluado usando el ensayo basado en CPE. El ensayo de dosis-respuesta fue diseñado para determinar el rango de eficacia para el antiviral seleccionado, es decir, la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) o la concentración efectiva (CE 50), así como su gama de citotoxicidad (CC 50). El ensayo ToAs fue empleado para el estudio inicial el Ministerio de Agricultura para determinar el mecanismo subyacente de los nuevos antivirales durante BTV ciclo de vida viral o el posible efecto en la maquinaria celular del huésped. Estos ensayos son de vital importancia para la evaluación de la eficacia antiviral en el sistema de cultivo de células, y se han utilizado para nuestras investigaciones recientes conducirción a la identificación de una serie de nuevos antivirales contra BTV.
Introduction
BTV es un virus ARN de cadena doble-prototipo en el género Orbivirus, familia Reoviridae. BTV es una de las enfermedades más importantes de los animales domésticos, incluyendo ovejas, cabras, ganado y otros animales domésticos, con la pérdida de $ 3 mil millones / año en todo el mundo 1,2. La exótica serotipo BTV es un patógeno animal importante que aparece en el "USDA Alta Consecuencia Ganado patógenos." Recientemente, la re-emergente de BTV ha causado un brote importante de la enfermedad en el ganado vacuno y ovino en varios países de todo el norte de Europa 3,4. Como resultado de su importancia económica y como un sistema modelo, BTV ha sido objeto de extensos estudios moleculares, genéticos y estructurales, y varios se han desarrollado vacunas. Sin embargo, debido a la falta de ensayos adecuados para el descubrimiento de fármacos antivirales, no hay antivirales disponibles contra BTV.
En una selección de alto rendimiento reciente campaña (HTS) usando BTV como el sistema modelo, developed, optimizado y validado un ensayo basado en CPE para identificar potenciales antivirales de amplio espectro contra los arbovirus 5. Ensayo basado-CPE es un ensayo bien reconocido que se ha utilizado en el descubrimiento de fármacos antivirales contra un número de virus que induce una rápida y observables CPE / apoptosis 5-7. En nuestro sistema, después de la infección BTV, el ECP es evidente en las células de vertebrados, incluyendo células HeLa, BSR, y HEK 293T 8. CPE inducida por BTV podría controlarse y cuantificarse utilizando diversos métodos de detección de la viabilidad celular, incluyendo el kit de reactivo de la viabilidad celular CellTiter Glo (kit de CTG) 9. Este kit determina el número de células viables en cultivo basado en la cuantificación del ATP celular presentado, que señala la presencia de células vivas metabólicamente activas. En condiciones optimizadas, el ensayo basado en CPE que aquí se presenta mostró su viabilidad con la "mezclar y medir" protocolo de un paso, y la flexibilidad con señales luminiscentes estables. Mientras tanto, los compuestos tóxicos Reducing la viabilidad celular se puede excluir en este ensayo basado en CPE. El ensayo basado en CPE mostró su robustez y fiabilidad para el descubrimiento de fármacos antivirales contra BTV, y se ha utilizado para detectar el NIH bibliotecas moleculares de moléculas pequeñas Repositorio (MLSMR), que conduce a la identificación de seis clúster novela de potencial compuesto de plomo antiviral (s ) 5.
Cuando un compuesto antiviral potencial ha sido identificado utilizando el ensayo basado en CPE, que tendrá que ser sometido al ensayo de dosis-respuesta de diez concentración para determinar el rango de eficacia antiviral y la citotoxicidad 2. La eficacia antiviral, representada como la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) o la concentración efectiva 50% (CE 50), es la concentración de un fármaco que inhibe a mitad de camino de CPE inducido por el virus entre la línea de base y máxima. La citotoxicidad de los antivirales, es decir, la concentración de la citotoxicidad 50% (CC 50), es la concentraciónde un fármaco que induce 50% de citotoxicidad entre la línea de base y máxima. El índice selectivo (SI), que se denota como 50% de Si (SI 50) se calcula a partir de CC 50 / IC 50 que determina la especificidad de la antiviral contra el CPE inducido por el virus. El IC 50 (o CE 50), CC 50 y SI 50 valores son medidas críticas para determinar si un compuesto antiviral es potente y selectivo para el desarrollo de drogas.
Cuando un antiviral no mostró toxicidad manifiesta in vitro, sin embargo, el virus impedido inducida CPE y el ciclo de vida viral productiva, es importante para caracterizar su Ministerio de Agricultura 2. Iniciamos dicha caracterización mediante la realización de ensayo de Toa para determinar el paso posible (s) del ciclo de vida del virus que queda afectada por el antiviral. En general, el compuesto antiviral se añadieron a las células a diferentes tiempos pre-o post-infección de virus. Si se añaden los antivirales a las células infectadas por publicar en su objetivo sTEP durante el curso de la infección, que daría lugar a una menor actividad en comparación con la que se añadió antes de la etapa. Así, el estudio ToAs es fundamental para determinar la eficacia antiviral de un compuesto, y su objetivo potencial, ya sea en el ciclo de vida viral o la maquinaria de acogida que participan en el ciclo de vida viral.
Para los tres ensayos, la viabilidad celular se determinó usando el kit de CTG siguiendo las instrucciones del fabricante 5. Este sistema de detección emite señales de luminiscencia adecuados que podrían ser analizados utilizando distintos programas informáticos en la empresa. Cada ensayo se validó y se realiza al menos por triplicado, con ocho réplicas. Para todos los datos obtenidos, tres parámetros, incluyendo valor medio (AVE), desviación estándar (STDEV), y coeficiente de variación (CV) se analizaron para determinar la robustez del ensayo. Una vez que la robustez del ensayo se ha determinado, serán analizados con mayor detalle los datos y se representan utilizando diversos bioestadística y gráficamenteherramientas de c 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para la identificación inicial de los accesos antivirales, uno de los pasos principales para el descubrimiento y desarrollo de fármacos antivirales es para desarrollar ensayos robustos, que incluye la selección de un marcador cuantificable, el desarrollo de un protocolo simple, la obtención de señales suficientes y menos de 10% de CV. La mayoría de las pantallas bioquímicos o basados en células están diseñados para proporcionar un punto de partida química basado en el, ensayo simple y de bajo costo más…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado por el subsidio 1R03MH08127-01 y 7R03MH08127-02 de los NIH para P. Li, y por los fondos de IMPACTO del Departamento de Medicina de la UAB a Q. Li. El apoyo del Fondo Molette y la Universidad de Auburn es apreciado. También agradecemos a las asistencias técnicas de la Sra. Pulin Che y el Sr. Volodymyr Musiienko durante el transcurso de la obra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
Riferimenti
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