In vitro per valutare l'impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

Summary

Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.

Abstract

Esaurimento delle cellule T è un fattore importante nella riuscita di liquidazione patogeno durante le infezioni virali croniche. Percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated su questa esposizione all'antigene corso e contribuiscono alla perdita della proliferazione, riduzione della funzione citolitica e compromessa produzione di citochine da parte di cellule T CD4 e CD8. Nel modello murino di infezione LCMV, somministrazione di bloccare anticorpi contro queste due vie aumentata risposte delle cellule T. Tuttavia, attualmente non vi è prova in vitro per misurare l'impatto di tale blocco sulla secrezione di citochine in cellule da campioni umani. Il nostro protocollo e approccio sperimentale ci consentono di quantificare con precisione e in modo efficiente il ripristino della produzione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 da soggetti infetti da HIV.

Qui, ci raffiguriamo un disegno sperimentale in vitro che consente misurazioni della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e il loro impatto su altri celsottoinsiemi l. Cellule T CD8 erano esaurite dal sangue intero e che restano PBMC sono state isolate tramite metodo di separazione Ficoll. PBMC CD8-impoverito sono state poi incubate con anticorpi bloccanti contro PD-L1 e / o IL-10Rα e, dopo stimolazione con HIV-1 piscina Gag peptide, le cellule sono state incubate a 37 ° C, 5% CO _2. Dopo 48 ore, il surnatante è stato raccolto per l'analisi di citochine da perline array e pellet cellulari sono stati raccolti sia per l'analisi fenotipica mediante citometria a flusso o l'analisi trascrizionale mediante qRT-PCR. Per un'analisi più dettagliata, diverse popolazioni cellulari sono stati ottenuti selettiva sottoinsieme esaurimento da PBMC o di classificare mediante citometria a flusso, prima di essere valutato negli stessi dosaggi. Questi metodi forniscono un approccio altamente sensibile e specifico per determinare la modulazione della produzione di citochine da parte di cellule T-helper antigene-specifiche e determinare interazioni funzionali tra diverse popolazioni di cellule immunitarie.

Introduction

Durante le infezioni virali persistenti, specifiche cellule-T virus acquisiscono difetti funzionali in un processo noto come l'esaurimento delle cellule T. All'inizio studi in vivo nel modello murino LCMV di infezione virale cronica indicato che le cellule T virus-specifici esauste una riduzione della funzione citolitica contro cellule infettate da virus, perdono la loro capacità di proliferare e una capacità ridotta di produrre citochine come IL-2, TNF- α e IFN-γ ^1,2. Complessa rete di percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated durante le infezioni croniche e contribuire alla disfunzione delle cellule T (recensito in

Protocol

1. Impoverimento e isolamento delle PBMC mediante Ficoll Separazione

1. Deplezione delle cellule T CD8 +, aggiungendo umano CD8 + Depletion Cocktail a 50 microlitri / ml di sangue intero.
2. Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (18-25 ° C).
3. Dopo l'incubazione, mescolare sangue intero con HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} e strato sopra Histopaque. Spin a 340 rcf per 30 minuti (senza freni, accelerazione lenta).
4. Raccogliere PBMC e trasferire in un nuovo conico 50ml. Lavare 2x con 45 ml RPMI 1640 supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di str....

Results

Per effettuare le misurazioni di citochine tramite questo sistema in vitro, è essenziale essere in grado di distinguere le risposte antigene-specifiche rispetto al controllo senza stimolazione. In generale, abbiamo preso in considerazione le risposte positive da tutti i valori della stimolazione antigenica che danno almeno tre volte aumento dei livelli di citochine rispetto al controllo nessuno stimolo e che erano all'interno della gamma lineare del test. Stiamo usando ad alta sensibilità saggi di matrice tallo.......

Discussion

Collezione surnatante è una parte fondamentale di questo progetto sperimentale. Durante la raccolta surnatanti per il dosaggio Luminex, sono state fatte aliquote e conservati a -80 ° C per evitare la degradazione della proteina causa gelo-disgelo. Congelamento e scongelamento può essere processi dure per le proteine, e riducendo al minimo freeze-disgelo, il segnale sarà massimizzata in saggi. Pertanto, è più facile ottenere dati ripetibile e preciso quando si lavora da aliquote che sono stati scongelati freeze-lo stesso.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione salina bilanciata di Hanks senza Ca2+ o Mg2+	Sigma	H9394
RPMI 1640	Sigma	R0883
Histopaque-1077	Sigma	10771
Siero umano AB	Gemini BioProducts	100-512
Penicillina/Streptomicina	Mediatech	30 001 CI
L-glutammina	Mediatech	25 005 CI
HEPES tampone	Mediatech	25060CI
Reagente bloccante FcR, umano	Miltenyi	130-059-901
RosetteSep Umano CD8+ Depletion Cocktail	Stem Cell	15663
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte riparabile, per eccitazione UV	Invitrogen	L23105
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Sistema di trascrizione inversa Improm-II	Promega	A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix	Agilent	600830
BD Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/Cytoperm	BD	554714
Tween-20	Fisher	BP337100
IFN-γ primer	Invitrogen		FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer	Invitrogen		FOR: TCATCTCTGCCCCCTCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG