Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.
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Articolo metodologico
In vitro per valutare l'impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esaurimento delle cellule T è un fattore importante nella riuscita di liquidazione patogeno durante le infezioni virali croniche. Percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated su questa esposizione all'antigene corso e contribuiscono alla perdita della proliferazione, riduzione della funzione citolitica e compromessa produzione di citochine da parte di cellule T CD4 e CD8. Nel modello murino di infezione LCMV, somministrazione di bloccare anticorpi contro queste due vie aumentata risposte delle cellule T. Tuttavia, attualmente non vi è prova in vitro per misurare l'impatto di tale blocco sulla secrezione di citochine in cellule da campioni umani. Il nostro protocollo e approccio sperimentale ci consentono di quantificare con precisione e in modo efficiente il ripristino della produzione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 da soggetti infetti da HIV.
Qui, ci raffiguriamo un disegno sperimentale in vitro che consente misurazioni della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e il loro impatto su altri celsottoinsiemi l. Cellule T CD8 erano esaurite dal sangue intero e che restano PBMC sono state isolate tramite metodo di separazione Ficoll. PBMC CD8-impoverito sono state poi incubate con anticorpi bloccanti contro PD-L1 e / o IL-10Rα e, dopo stimolazione con HIV-1 piscina Gag peptide, le cellule sono state incubate a 37 ° C, 5% CO 2. Dopo 48 ore, il surnatante è stato raccolto per l'analisi di citochine da perline array e pellet cellulari sono stati raccolti sia per l'analisi fenotipica mediante citometria a flusso o l'analisi trascrizionale mediante qRT-PCR. Per un'analisi più dettagliata, diverse popolazioni cellulari sono stati ottenuti selettiva sottoinsieme esaurimento da PBMC o di classificare mediante citometria a flusso, prima di essere valutato negli stessi dosaggi. Questi metodi forniscono un approccio altamente sensibile e specifico per determinare la modulazione della produzione di citochine da parte di cellule T-helper antigene-specifiche e determinare interazioni funzionali tra diverse popolazioni di cellule immunitarie.
Introduzione
Durante le infezioni virali persistenti, specifiche cellule-T virus acquisiscono difetti funzionali in un processo noto come l'esaurimento delle cellule T. All'inizio studi in vivo nel modello murino LCMV di infezione virale cronica indicato che le cellule T virus-specifici esauste una riduzione della funzione citolitica contro cellule infettate da virus, perdono la loro capacità di proliferare e una capacità ridotta di produrre citochine come IL-2, TNF- α e IFN-γ 1,2. Complessa rete di percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated durante le infezioni croniche e contribuire alla disfunzione delle cellule T (recensito in
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Protocollo
1. Impoverimento e isolamento delle PBMC mediante Ficoll Separazione
- Deplezione delle cellule T CD8 +, aggiungendo umano CD8 + Depletion Cocktail a 50 microlitri / ml di sangue intero.
- Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (18-25 ° C).
- Dopo l'incubazione, mescolare sangue intero con HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca 2 + o Mg 2 +) e strato sopra Histopaque. Spin a 340 rcf per 30 minuti (senza freni, accelerazione lenta).
- Raccogliere PBMC e trasferire in un nuovo conico 50ml. Lavare 2x con 45 ml RPMI 1640 supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di str....
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Risultati
Per effettuare le misurazioni di citochine tramite questo sistema in vitro, è essenziale essere in grado di distinguere le risposte antigene-specifiche rispetto al controllo senza stimolazione. In generale, abbiamo preso in considerazione le risposte positive da tutti i valori della stimolazione antigenica che danno almeno tre volte aumento dei livelli di citochine rispetto al controllo nessuno stimolo e che erano all'interno della gamma lineare del test. Stiamo usando ad alta sensibilità saggi di matrice tallo.......
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Discussione
Collezione surnatante è una parte fondamentale di questo progetto sperimentale. Durante la raccolta surnatanti per il dosaggio Luminex, sono state fatte aliquote e conservati a -80 ° C per evitare la degradazione della proteina causa gelo-disgelo. Congelamento e scongelamento può essere processi dure per le proteine, e riducendo al minimo freeze-disgelo, il segnale sarà massimizzata in saggi. Pertanto, è più facile ottenere dati ripetibile e preciso quando si lavora da aliquote che sono stati scongelati freeze-lo stesso.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo Gordon Freeman per fornire l'anticorpo blocco anti-PD-L1. Ringraziamo il personale clinico e di laboratorio presso il Massachusetts General Hospital e tutti i partecipanti di studio per il loro prezioso ruolo in questo progetto.
Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie Infettive dei National Institutes of Health (PO1 AI-080192; DEK), il National Heart Lung and Blood Institute dei National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK è supportato da un Research Scholar Premio alla Carriera della Salute Research Fund Quebec (FRQS). FP è supportata da una sovvenzione borsa di studio del G....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina bilanciata di Hanks senza Ca2+ o Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Siero umano AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillina/Streptomicina | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutammina | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES tampone | Mediatech | 25060CI | |
| Reagente bloccante FcR, umano | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Umano CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte riparabile, per eccitazione UV | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sistema di trascrizione inversa Improm-II | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCTCTGCCCCCTCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Riferimenti
- Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
- Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R.
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Ristampe e permessi
