JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

In vitro Coculture Assay at vurdere Patogen induceret Neutrophil Trans-epitel Migration

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50823
, , ,
1Department of Pediatrics,Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology,MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital

Summary

Neutrofil trans-epitelmigration som reaktion på slimhindebakteriel infektion bidrager til epitelskader og kliniske sygdomme. En in vitro-model er blevet udviklet, der kombinerer patogen, humane neutrofiler og polariserede menneskelige epitelcellelag dyrket på transwellfiltre for at lette undersøgelser mod optrævling af de molekylære mekanismer, der orkestrerer dette fænomen.

Abstract

Slimhindeoverflader tjener som beskyttende barrierer mod patogene organismer. Medfødte immunrespons aktiveres ved sensing patogen, der fører til infiltration af væv med migrerende inflammatoriske celler, primært neutrofiler. Denne proces har potentiale til at være ødelæggende for væv, hvis overdreven eller holdt i en uløst tilstand.  Cocultured in vitro modeller kan bruges til at studere de unikke molekylære mekanismer, der er involveret i patogen induceret neutrofil trans-epitel migration. Denne type model giver alsidighed i eksperimentelt design med mulighed for kontrolleret manipulation af patogenet, epitelbarrieren eller neutrofil. Patogen infektion af den apikale overflade af polariserede epitelmonolag, der dyrkes på gennemtrængelige transwellfiltre, anstifter fysiologisk relevant basolateral til apikale trans-epitelmigration af neutrofiler, der påføres basolateraloverfladen. Den in vitro-model, der er beskrevet heri, viser de mange trin, der er nødvendige for at demonstrere neutrofil migration på tværs af et polariseret lungeepitelemonolag, der er inficeret med patogen P. aeruginosa (PAO1). Såning og dyrkning af gennemtrængelige transwells med humane afledte lungeepitele celler er beskrevet sammen med isolering af neutrofiler fra fuldblod og dyrkning af PAO1 og nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).  Emigrationsprocessen og den kvantitative analyse af migrerede neutrofiler, der er blevet mobiliseret som reaktion på patogen infektion, er vist med repræsentative data, herunder positive og negative kontroller. Dette in vitro-modelsystem kan manipuleres og påføres andre slimhindeoverflader. Inflammatoriske reaktioner, der involverer overdreven neutrofil infiltration, kan være ødelæggende for værtsvæv og kan forekomme i mangel af patogene infektioner. En bedre forståelse af de molekylære mekanismer, der fremmer neutrofil trans-epitelmigration gennem eksperimentel manipulation af det in vitro-cokultur assay-system, der er beskrevet heri, har et betydeligt potentiale til at identificere nye terapeutiske mål for en række mukosale infektiøse såvel som inflammatoriske sygdomme.

Introduction

Slimhindeoverflader tjener som fysiske og immunologiske barrierer, der giver beskyttelse mod eksterne trusler, der er udbredt i miljøet1,2. Denne beskyttende epitelbarriere kan kompromitteres, når patogene organismer invaderer2. I tilfælde af et bakterielt patogen anstifter dette møde ofte en inflammatorisk proces ved at aktivere det medfødte immunsystem og udløse en hurtig mobilisering af førstehjælpere granulocytter kendt som neutrofiler2-4. Kemotaktiske midler, der letter neutrofil rekruttering, produceres delvis af slimhindeepitelecellerne, der søger at befri værten for det ulovlige patogen2-4. Overdreven eller uløst neutrofil infiltration af slimhindeepitelets overflade kan forårsage betydelig patologi1,5. Dette er en konsekvens af uspecifikke vævsskader forårsaget af antibakterielt neutrofilarsenal5-7. I sådanne tilfælde overskygges neutrofilers bakterielle clearancekapacitet af ødelæggelse af værtsvæv under en smitsom fornærmelse.  Forstyrrelse af den beskyttende epitelbarrierefunktion kan føre til øget eksponering af underliggende væv for mikroorganismer og/eller toksiner, hvilket yderligere forværrer sygdomspatologien8,9. Disse konsekvenser kan observeres i flere organsystemer, herunder lungerne og fordøjelseskanalen1,5. Desuden er ikke-infektiøse inflammatoriske tilstande som alvorlige anfald af astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), akut respiratorisk nødsyndrom (ARDS) og inflammatorisk tarmsygdom (IBD) præget af det patologiske brud på slimhinde epitelbarrieren ved en overdreven neutrofil reaktion4,5,10-12.

Den komplekse proces med neutrofil rekruttering efter slimhindeinfektion involverer flere opdelte trin1,5,13,14. For det første skal neutrofiler afvige fra cirkulation via en række celle-til-celle-interaktioner, der letter trans-endotelmigration1,13. Neutrofiler navigerer derefter i eksisterende interstitiel plads, der indeholder ekstracellulær matrix1,14. For at nå lumen af den inficerede slimhinde skal neutrofiler derefter migrere over epitelbarrieren1,4,5. Dette indviklede multistep fænomen undersøges ofte samlet ved hjælp af in vivo dyremodeller af infektion15. Sådanne modeller er nyttige til at fastslå nødvendigheden af specifikke faktorer, såsom kemokiner, vedhæftningsmolekyler eller signalveje, der deltager i den samlede proces, men er stort set utilstrækkelige til at løse molekylære bidrag, der er kritiske for hvert særskilt opdelt trin16. Cocultured in vitro-systemer, der modellerer trans-endothelial, trans-matrix eller trans-epitelmigration af neutrofiler, har været særlig nyttige i denne henseende1.14,16,17.

Der er udviklet et robust cokulturanalysesystem med henblik på dechifrering af mekanismer, der er ansvarlige for neutrofil trans-epitelmigration som reaktion på patogen infektion18-22. Denne model indebærer at inficere den apikale overflade af polariserede menneskelige epitelcellelag med et bakterielt patogen efterfulgt af anvendelse af frisk isolerede menneskelige neutrofiler på basolateraloverfladen18-22. Neutrofiler migrerer over epitelbarrieren som reaktion på epitelbaserede kemotaktiske produkter, der udskilles efter patogen infektion18,21-23. Dette modelsystem er blevet anvendt ved hjælp af tarm- og lungeepitele kulturer, der er udsat for passende vævsspecifikke bakterielle patogener, og har afsløret nye molekylære mekanismer, der sandsynligvis er vigtige for den neutrofile rekrutteringsproces under slimhindeinfektion3,8,19,24-28. Styrken af denne in vitro coculture model er, at en reduktionistisk tilgang gør det muligt for investigator at eksperimentelt manipulere patogenet, epitelbarrieren og / eller neutrofil i et velkontrolleret, meget reproducerbart, ret billigt system. Indsigt indsamlet fra denne tilgang kan effektivt udnyttes til at gennemføre fokuseret analyse af opdelte begivenheder under neutrofil rekruttering ved hjælp af in vivo infektion modeller22,29,30.

Denne artikel viser de mange trin, der er nødvendige for en vellykket etablering af denne reproducerbare model for at udforske patogeninduceret neutrofil trans-epitelmigration. Lunge epitelbarrierer inficeret med patogenet Pseudomonas aeruginosa er omtalt i denne artikel; andre vævs epithelia og patogener kan dog erstattes med mindre ændringer. Såning og dyrkning af polariserede lunge epitelcellelag på omvendt kollagen belagt gennemtrængelig transwell filtre er beskrevet heri, som er væksten af patogene P. aeruginosa og isolering af neutrofiler fra fuldblod. Hvordan disse komponenter kombineres for at observere patogeninduceret neutrofil trans-epitelmigration præsenteres sammen med passende positive og negative kontroller for at etablere en reproducerbar analyse. Alsidigheden af denne tilgang til at undersøge forskellige aspekter af patogen induceret neutrofil trans-epitel migration diskuteres med henvisning til specifikke undersøgelser i litteraturen.

Protocol

Trin (1-3) skal udføres i et sterilt miljø under en laminar flow hætte. 1. Kollagen Coating Transwells Lav en 30 μg/ml kollagenopløsning. 3 mg/ml kollagenbestand 1:100 fortyndes i 60% ethanol, der er passeret gennem en 0,2 μm filterenhed. Hvirvelfortyndet 30 μg/ml opløsning. Bemærk: Det er ikke nødvendigt at hvirvle 3 mg/ml kollagenbestandsopløsningen, da denne opløsning er ret tyktflydende, og der kan indføres luftbobler, hvilket potentielt reducerer…

Representative Results

Flere undersøgelser har vist, at patogeninficerede epitellag letter neutrofil trans-epitelmigration3,8,19,24-28,31,32. Dette sker via en patogenspecifik induktion af en epitelcelleafledt neutrofil kemotaktisk gradient3,23. For eksempel forårsager patogen P. aeruginosa, der interagerer med lungeepitelecellernes apikale overflade, et betydeligt antal neutrofiler til at migrere over epitellaget18,22,25,26,33,34. Dette klinisk relevante analysesystem kan manipuleres på mange måde…

Discussion

Neutrofil migration på tværs af slimhinde epiteloverflader er et almindeligt træk i sygdomspatologi efter infektion med bakterielle patogener3. Den metode, der er beskrevet heri, tilbyder en hurtig, ligetil tilgang til eksperimentelt at isolere denne diskrete begivenhed ved hjælp af en menneskelig celle afledt in vitro coculture assay system, der modellerer et træk ved den inflammatoriske proces udløst af bakterielle infektioner. Dette system blev oprindeligt udviklet ved hjælp af polariserede …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet økonomisk af NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich  C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich  S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich  D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich  213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich  S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich  ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich  H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich  H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich  SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich  A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich  H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich  F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil’s role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

In Vitro CocultureNeutrophil Trans-epithelial MigrationMucosal ImmunityPathogenic InfectionPolarized Epithelial MonolayerNeutrophil InfiltrationInflammatory ResponseTherapeutic Targets

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image