The Slice Kultur Metode for følgende utvikling av Tooth Germs I Eksplantering Kultur

Summary

Her har vi detalj en metode for å kultur tann bakterier i kjeven skiver ved hjelp av en vev chopper. Denne metoden gir en unik tilgang til tannen under utvikling, og gir utmerket mulighet for manipulasjon og avstamning tracing, ikke tilgjengelig ved hjelp av mer tradisjonelle kultur metoder.

Abstract

Eksplantering kultur tillater manipulering av å utvikle organer på bestemte tidspunkter og er derfor en viktig metode for utviklingsbiologen. For mange organer er det vanskelig å få tilgang til utvikling av vev for å tillate overvåking under ex vivo kultur. Stykket kultur metoden gir tilgang til vev slik at morphogenetic bevegelser kan følges og spesifikke cellepopulasjoner kan være målrettet for manipulasjon eller avstamning sporing.

I denne artikkelen beskriver vi en metode for skive kultur som har vært svært vellykket for kultur av tann bakterier i en rekke arter. Metoden gir utmerket tilgang til tannen bakterier, som utvikler på et tilsvarende sats til den som ble observert in vivo, omgitt av de andre kjeve vev. Dette tillater vev interaksjoner mellom tannen og omgivende vev som skal overvåkes. Selv om dette dokumentet fokuserer på tann bakterier, kan den samme fremgangsmåte anvendes for å følge utviklingen av en rekkeav andre organer, som for eksempel spyttkjertler, Meckels brusk, nese kjertler, tunge og øre.

Introduction

For en rekke eksperimenter er det viktig å være i stand til kultur vev ex vivo for å følge utviklingen. Dyrkning av utvikling av vev gir tilgang ved definerte perioder med utvikling og tillater manipulasjon av genene ved tilsetning av faktorer til kulturmediet eller på lastet perler og ved bruk av transfeksjon og elektroporering ^1.. For mange eksperimenter er det viktig å være i stand til å visualisere vevet som det vokser, for eksempel, for å følge skjebnen til lineage merkede celler som vevet gjennomgår morphogenesis. Dette kan være spesielt problematisk for vev som utvikler seg dypt inne i embryo, som ikke er åpenbare når en blokk av vev fra embryo dyrkes. Tennene er gode eksempler på dette, som de utvikler i kjeven, overkjeve og frontal nasal prosessen. Når hele kjeven blir dyrket overfladiske strukturer av tannen kan sees, men forandringer i morfologi kan bare analyseres etter snitting av fast vev <sopp> to. Vi har tilpasset en live skive kultur teknikken tillater oss å følge tann bakterie utvikling og gi tilgang til de ulike deler av tannen under utvikling. Teknikken kulturer tann bakterie skiver på gass-væske-grensesnittet, ved hjelp av en modifisert Trowell metode ^tre. Disse skive kulturer har vært svært nyttig i direkte følge morfogenese av tannen, og slik avstamning sporing av forskjellige komponenter, for eksempel emalje knute og tann papilla og hårsekken ^1,4-7. Teknikken er ikke begrenset til museembryoer og har med hell blitt brukt til kultur live-skiver av gris og slange dental vev ^8,9. I tillegg til fordelen ved å være i stand til å visualisere tannutvikling, har den skive-metoden har også den fordel at de tynne skiver av vev har økt tilgang på næringsstoffer fra mediet og luft fra inkubatoren. Dette resulterer i forbedret vekst av tann bakterier, som svarer til utvikling av in vivo, og viser invasion av endotelceller i papilla ^7.. I motsetning til dette tann bakteriene i hele kjevebenet kulturer utvikle langsommere enn de som er in vivo, og sentrum av kulturen er ofte nekrotisk i langtidskulturer. I skive kultur, utvikler tannen i løpet av en skive i kjeven, og dets interaksjon med det omgivende ben, og utvikling av andre vev kan overvåkes. I vår metode vevet er hakket rett etter disseksjon uten behov for å bygge inn i en støtte medium ^10,11 og ikke behov for noen system for å feste vevet til hoggestabben. Fremgangsmåten er derfor ikke-invasiv og hurtig, slik at mange kjever for å bli delt i en sesjon.

Protocol

En. Set Up Skjerp instrumentene disseksjon (ved hjelp av en skjerping stein smurt med mineralolje) og sterilisere før bruk for orgel kultur ved hjelp av en 70% etanol spray og tørr-varme sterilisering. Skjerpe disseksjon nåler ved hjelp av elektrolyse i 2 M natriumhydroksid ved hjelp av en 12 V-forsyningen. Forbered kultur medium som brukes for disseksjon og kultur av embryonale organer, som består av Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) supplert med 1% Glutamax og 1% penicill…

Representative Results

For å følge bevegelsen av den første molar tann hårsekken, ble 250 mikrometer frontale snitt tatt gjennom en underkjeve med metoden som er beskrevet ovenfor. Tann follicle er laget av mesenchyme som omgir den ytre emalje epitel (OEE) av den tredje tann, og har tidligere blitt vist å ta del i dannelsen av vev av periodontium 6.. Kjever ble dissekert ved E14.5, hetten stadium av tannutvikling. I stykket omrisset av tann epitel var klar, og den kondenserende tann mesenchyme kan bli identifisert som en mørk…

Discussion

Denne metoden for tannkulturen har den fordel at tilgang til tannen bakterie er utmerket, slik at nøyaktig avstamning oppsporing og plassering av perler i epitelet, eller mesenchyme. Definerte regioner i utviklings tann bakterie kan derfor være spesielt målrettet. Under kultur skiftende morfologi av tannen bakterie kan følges, og effekten av manipulasjoner raskt vurderes.

Fremgangsmåten er imidlertid bare egnet for små tann bakterier før vesentlig dannelse av hardt vev, for eksempel d…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
	Invitrogen
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cell-labeling solution
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
	Invitrogen
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size)	BD Falcon	353090	PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten wire 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspirator tubes	Sigma	A5177	Used for mouth aspiration lineage tracers