Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura

Sommario

Qui ci dettaglio un metodo per cultura germi denti in fette mandibola con un chopper tessuto. Questo metodo consente l'accesso esclusivo al dente durante lo sviluppo, fornendo un'ottima opportunità per la manipolazione e lignaggio tracing, non disponibile utilizzando metodi di coltura più tradizionali.

Abstract

Cultura espianto permette la manipolazione di sviluppare organi in punti temporali specifici ed è quindi un metodo importante per il biologo dello sviluppo. Per molti organi è difficile accedere tessuto sviluppo per consentire il controllo nelle ex vivo cultura. Il metodo di coltura fetta permette l'accesso al tessuto in modo che i movimenti morfogenetici possono essere seguiti e specifiche popolazioni cellulari possono essere oggetto di manipolazione o lineage tracing.

In questo articolo descriviamo un metodo di cultura fetta che ha avuto molto successo per la cultura di germi denti in una vasta gamma di specie. Il metodo fornisce un eccellente accesso ai germi dei denti, che si sviluppano a un ritmo simile a quello osservato in vivo, circondato da altri tessuti della mascella. Questo permette interazioni tessuto tra il dente e del tessuto circostante da monitorare. Sebbene questo documento si concentra sulla germi dei denti, lo stesso protocollo può essere applicato a seguire lo sviluppo di un numerodi altri organi, come ad esempio le ghiandole salivari, cartilagine di Meckel, ghiandole nasali, lingua e orecchie.

Introduzione

Per una serie di esperimenti è importante essere in grado di coltura di tessuti ex vivo per seguire lo sviluppo. Cultura di sviluppo del tessuto fornisce l'accesso a determinati periodi di sviluppo e permette la manipolazione dei geni con l'aggiunta di fattori al terreno di coltura, o microsfere caricate, e con l'uso di trasfezione e elettroporazione ^1. Per molti esperimenti è importante essere in grado di visualizzare il tessuto come cresce, per esempio, per seguire il destino di cellule della linea etichettato come il tessuto subisce morfogenesi. Questo può essere particolarmente problematico per i tessuti che si sviluppano in profon....

Protocollo

1. Avviare

1. Affinare gli strumenti di dissezione (utilizzando una pietra per affilare lubrificato con olio minerale) e sterilizzare prima di utilizzare per la cultura d'organo con un spruzzo di etanolo al 70% e la sterilizzazione a calore secco. Contrasta gli aghi di dissezione mediante elettrolisi a 2 M di idrossido di sodio con una alimentazione a 12 V.
2. Preparare il terreno di coltura utilizzati per la dissezione e la cultura di organi embrionali, costituito Modified Eagle Medium F12 Advanced Dulbecco (DMEM F12) supplementato con 1% GlutaMAX e 1% di penicillina-streptomicina.

2. Embrione dissezione

Risultati

Al fine di seguire il movimento del primo follicolo dentale molare, 250 micron fette frontali sono stati prelevati attraverso una mandibola con il metodo sopra descritto. Il follicolo dentale è lo strato di mesenchima che circonda lo smalto epitelio esterno (OEE) del dente di sviluppo, ed è stato già dimostrato di partecipare alla formazione di tessuto del periodonto ^6. Mandibole sono stati sezionati a E14.5, nella fase tappo dello sviluppo dei denti. Nella fetta il contorno dell'epitelio dentale era chiaro, .......

Discussione

Questo metodo di coltura dente ha il vantaggio che l'accesso al germe dente è eccellente, consentendo lignaggio accurato tracciamento e posizionamento di perline all'interno dell'epitelio o mesenchima. Regioni definite del dente di sviluppo germe possono quindi essere specificamente mirati. Durante la coltura morfologia mutevole del germe dente può essere seguito, e l'effetto di manipolazioni valutato rapidamente.

Il metodo, tuttavia, è adatto solo per giovani germi dente pri.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo	VWR	101077Y	100% etanolo è stato diluito in H2O distillato al 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillina-streptomicina	Sigma	P0781
DiI (sonde molecolari)	Vybrant	V-22885	Soluzione
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( Sonde molecolari)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Sterilizzazione a calore secco
Tritatessuti McIlwain	Ted Pella, Inc.	10180	da tavolo standard
(piatto per coltura di organi Center-Well)	Membrane per	353037
(inserti per colture cellulari, 0,4 μ BD	Falcon	353090	Membrana incisa su pista in PET, formato a 6 pozzetti
Griglie metalliche (Acciaio Inox - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubatore	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Picospritzer a canale singolo III
Capillare in vetro con filamento 1 mm	WPI	TW100F-4
Filo di tungsteno 0,1 mm	Goodfellow	W005138
Filo di tungsteno 0,38 mm	Goodfellow	W005155
Tubi aspiratore	Sigma	A5177	Utilizzato per traccianti di linea di aspirazione della bocca

di marcatura cellulare Piatto per coltura di organi Falcon