Summary

El método de cultivo de la rebanada por Siguiendo desarrollo de gérmenes de dientes en Explante Cultura

Published: November 13, 2013
doi:

Summary

Aquí detallamos un método de cultivo de gérmenes dentales en rodajas mandíbula usando un cortador de tejidos. Este método permite un acceso único a los dientes durante el desarrollo, que proporciona una excelente oportunidad para la manipulación y el linaje de rastreo, no está disponible utilizando métodos de cultivo más tradicionales.

Abstract

Cultura explante permite, por tanto, la manipulación de desarrollar órganos en puntos específicos de tiempo y es un método importante para el biólogo del desarrollo. Para muchos órganos es difícil acceder a los tejidos en desarrollo para permitir el monitoreo durante el cultivo ex vivo. El método de cultivo de cortes permite el acceso a los tejidos para que los movimientos morfogenéticos pueden ser seguidos y poblaciones específicas de células pueden ser objeto de manipulación o rastreo de linaje.

En este trabajo se describe un método de cultivo de cortes que ha sido muy exitoso para el cultivo de los gérmenes de los dientes en una amplia gama de especies. El método proporciona un excelente acceso a los gérmenes de los dientes, que se desarrollan a un ritmo similar al observado in vivo, rodeado de los otros tejidos de la mandíbula. Esto permite interacciones de tejido entre el diente y el tejido circundante a controlar. Aunque este documento se concentra en los gérmenes de los dientes, el mismo protocolo se puede aplicar a seguir el desarrollo de un númerode otros órganos, como las glándulas salivales, el cartílago de Meckel, glándulas nasales, lengua y orejas.

Introduction

Para un número de experimentos es importante ser capaz de cultivo de tejidos ex vivo para seguir el desarrollo. Cultura de desarrollar tejido proporciona acceso a determinados períodos de desarrollo y permite la manipulación de los genes por la adición de factores al medio de cultivo, o en perlas cargadas, y por el uso de la transfección y la electroporación 1. Para muchos experimentos es importante ser capaz de visualizar el tejido a medida que crece, por ejemplo, para seguir el destino de las células de linaje etiquetado como el tejido se somete a la morfogénesis. Esto puede ser particularmente problemático para los tejidos que se desarrollan profunda dentro del embrión, que no son evidentes cuando un bloque de tejido del embrión se cultiva. Los dientes son buenos ejemplos de esto, a medida que se desarrollan dentro del proceso nasal mandíbula, maxilar y frontal. Cuando se cultiva toda la mandíbula las estructuras superficiales de los dientes se pueden ver pero los cambios en la morfología sólo pueden ser analizados después de la sección de tejido fijado <shasta> 2. Hemos adaptado una técnica de cultivo de cortes en directo lo que nos permite seguir el desarrollo de gérmenes del diente y el acceso a las diferentes partes del diente durante el desarrollo. Las culturas técnica de las rodajas de germen del diente en la interfase gas-líquido, utilizando un método modificado Trowell 3. Estos cultivos de cortes han sido muy útiles en directamente después de la morfogénesis del diente, y permitiendo linaje rastreo de componentes distintos, tales como el nudo del esmalte y la papila dental y el folículo 1,4-7. La técnica no se limita a los embriones de ratón y con éxito se ha utilizado para la cultura en vivo rebanadas de cerdo y la serpiente 8,9 tejido dental. Además de la ventaja de ser capaces de visualizar el desarrollo del diente, el método rebanada también tiene la ventaja de que las rodajas delgadas de tejido han aumentado el acceso a los nutrientes del medio y el aire de la incubadora. Esto se traduce en un mejor crecimiento de los gérmenes de los dientes, que coinciden con el desarrollo in vivo y espectáculo La invasión masde iones de las células endoteliales en la papila 7. En contraste, los gérmenes de los dientes en la mandíbula culturas enteros desarrollan más lento que los in vivo y el centro de la cultura es a menudo necrótico en cultivos a largo plazo. En la cultura rebanada, el diente se desarrolla dentro de un trozo de la mandíbula, y su interacción con el hueso circundante y el desarrollo de otros tejidos puede ser monitoreado. En nuestro método, el tejido se corta recta después de la disección sin necesidad de integrar en un medio de soporte 10,11 y no hay necesidad para cualquier sistema para sujetar el tejido a la guillotina. El método es, por tanto, no invasiva y rápida, permitiendo que muchos mandíbulas que se seccionaron en una sesión.

Protocol

1. Establecer Enfocar los instrumentos de disección (con una piedra de afilar lubricado con aceite mineral) y esterilizar antes de su uso para el cultivo de órganos utilizando un spray de etanol al 70% y la esterilización de calor seco. Afilar las agujas de disección utilizando la electrólisis en 2 M de hidróxido de sodio utilizando un suministro de 12 V. Preparar el medio de cultivo utilizado para la disección y la cultura de órganos embrionarios, que consta de modificación F12 Medio Eagle…

Representative Results

Con el fin de seguir el movimiento de la primera folículo dental molar, 250 micras rodajas frontales fueron tomadas a través de una mandíbula utilizando el método descrito anteriormente. El folículo dental es la capa de mesénquima que rodea el epitelio del esmalte exterior (OEE) del diente en desarrollo, y se ha mostrado previamente para tomar parte en la formación de tejido del periodonto 6. Mandíbulas fueron disecados en E14.5, la etapa de desarrollo de los dientes cap. En la rebanada el contorno de…

Discussion

Este método de la cultura de los dientes tiene la ventaja de que el acceso a la germen del diente es excelente, lo que permite linaje precisa la localización y la colocación de los granos en el epitelio o el mesénquima. Por lo tanto, las regiones definidas del germen dentario en desarrollo pueden ser dirigidos específicamente. Durante el cultivo de la morfología cambiante de la germen del diente se puede seguir, y el efecto de las manipulaciones evaluarse rápidamente.

El método, sin …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sarah A. Alfaqeeh es financiado por Kind Saud University College de Odontología, Ministerio de Educación Superior, Reino de Arabia Saudita.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 101077Y 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12 Gibco 12634-010 Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX Gibco 35050-061
Invitrogen
Penicillin-streptomycin Sigma P0781
DiI (Molecular probes) Vybrant V-22885 Cell-labeling solution
Invitrogen Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes) Vybrant V22886
Invitrogen
Geminator 500 Thomas Thomas No. 3885A20 Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper Ted Pella, Inc. 10180 Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) Falcon 353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) BD Falcon 353090 PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) Goodfellow FE228710 (Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator Nuaire NU-5500
Picospritzer III Intracel Ltd 051-0500-900 0-100 psi Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm WPI TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm Goodfellow W005138
Tungsten wire 0.38 mm Goodfellow W005155
Aspirator tubes Sigma A5177 Used for mouth aspiration lineage tracers

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Citazione di questo articolo
Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture. J. Vis. Exp. (81), e50824, doi:10.3791/50824 (2013).

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