Den Slice Kultur Metod för att följa utveckling av Tand bakterier i Explantation kultur

Summary

Här vi detalj en metod att odla tand bakterier i käken skivor med hjälp av en vävnad chopper. Denna metod ger unik tillgång till tanden under utveckling, vilket ger utmärkta möjligheter till manipulation och härstamning spårning, inte tillgänglig att använda mer traditionella odlingsmetoder.

Abstract

Explantation kultur tillåter manipulering av att utveckla organ vid specifika tidpunkter och är därför en viktig metod för utvecklings-biolog. För många organ är det svårt att komma åt att utveckla vävnad för att möjliggöra övervakning under ex vivo kultur. Den bit kultur Metoden ger tillgång till vävnaden så att morfogenetiska rörelser kan följas och specifika cellpopulationer kan måltavlan för manipulation eller härstamning spårning.

I denna uppsats beskriver vi en metod för bit kultur som har varit mycket framgångsrik för odling av tand bakterier i en rad arter. Metoden ger utmärkt tillgång till tand bakterier, som utvecklas i samma utsträckning som den som observerats in vivo, omgiven av de andra käken vävnader. Detta tillåter vävnadsinteraktioner mellan tanden och omgivande vävnaden som skall övervakas. Även om detta dokument koncentrerar sig på tandgroddar kan samma protokoll skall tillämpas för att följa utvecklingen av ett antalav andra organ, t.ex. spottkörtlar, Meckels brosk, nasalkörtlar, tungan och örat.

Introduction

För ett antal experiment är det viktigt att kunna kultur vävnad ex vivo för att följa utvecklingen. Kultur för utveckling av vävnad ger tillgång vid definierade perioder av utveckling och tillåter manipulering av gener genom tillsats av faktorer till odlingsmediet, eller den laddade kulor, och med hjälp av transfektion och elektroporering ^1. För många experiment är det viktigt att kunna visualisera den vävnad som den växer, till exempel, för att följa ödet av härstamnings märkta celler som vävnaden genomgår morfogenes. Detta kan vara särskilt problematiskt för vävnader som utvecklas djupt inuti embryot, som inte är uppenbar när ett block av vävnad från embryot odlas. Tänder är bra exempel på detta, eftersom de utvecklas i underkäken, överkäken och frontala nasala processen. När hela underkäken odlas de ytliga strukturer tanden kan ses, men förändringar i morfologi endast kan analyseras efter sektionering av fast vävnad <supp> 2. Vi har anpassat en live-skiva kultur teknik gör det möjligt att följa tandgroddar utveckling och ger tillgång till de olika delarna av tanden under utveckling. Kulturerna technique tanden groddar skivor vid gas-vätskegränsytan, med användning av en modifierad Trowell metod ^3. Dessa skiva kulturer har varit mycket användbara i direkt följande morfogenes av tanden, och tillåter härstamning spårning av distinkta komponenter, såsom emalj knut och den dentala papillen och follikelstimulerande ^1,4-7. Tekniken är inte begränsad till musembryon och har framgångsrikt använts för att kultur levande skivor av gris och orm tandvävnad ^8,9. Förutom fördelen av att kunna visualisera tandutveckling, slice metod har också den fördelen att de tunna skivor av vävnad ha ökad tillgång till näringsämnen från mediet och luft från inkubatorn. Detta resulterar i ökad tillväxt av tand bakterier, vilket motsvarar utvecklingen in vivo, och show invasion av endotelceller in i papilla ^7. Däremot tand bakterier i hela käken kulturer utvecklas långsammare än de som in vivo och centrum för kulturen är ofta nekrotisk i långsiktiga kulturer. I bit kultur, utvecklar tanden inom en del av käken, och dess samspel med det omgivande utveckla ben och andra vävnader kan övervakas. I vår metod vävnaden hackas direkt efter dissektion utan att behöva bädda i ett stödmedium ^10,11 och inget behov av något system för att fästa vävnaden till huggkubben. Metoden är alltså icke-invasiv och snabb, vilket gör att många mandibles som ska snittas i en session.

Protocol

1. Konfigurera Slipa dissektionsinstrument (med en slipsten smörjs med mineralolja) och sterilisera före användning för organkultur med hjälp av en 70% etanol spray och torrvärmesterilisering. Slipa dissektion nålar med hjälp av elektrolys i 2 M natriumhydroxid med hjälp av en 12 V matning. Förbered odlingsmedium som används för dissekering och odling av embryonala organ, bestående av Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) kompletterat med 1% GlutaMAX och 1% penicillin-…

Representative Results

I syfte att följa rörelsen hos den första molar tand follikel var 250 fim frontala skivor tas genom en underkäken med hjälp av den ovan beskrivna metoden. Den dentala follikeln är skiktet av mesenkym som omger den yttre emalj epitelet (OEE) av framkallnings tand, och har tidigare visats att delta i bildningen av vävnad hos periodontium 6. Mandibles dissekerades vid E14.5, locket skede av tandutveckling. I segmentet var konturerna av tand epitel klar, och den kondensetand mesenkymet kunde identifieras s…

Discussion

Denna metod för tand kultur har den fördelen att tillgång till tandgroddar är utmärkt, vilket tillåter noggrann härstamning spårning och placeringen av pärlorna inom epitelet eller mesenkym. Definierade områden av utvecklingstand grodden kan därför vara särskilt inriktade. Under kultur den förändrade morfologin av tanden grodden kan följas, och effekten av manipulationer snabbt utvärderas.

Metoden är emellertid endast lämplig för unga tand bakterier innan betydande bildni…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
	Invitrogen
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cell-labeling solution
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
	Invitrogen
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size)	BD Falcon	353090	PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten wire 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspirator tubes	Sigma	A5177	Used for mouth aspiration lineage tracers