Stress-induceret antibiotika modtagelighed Test på en chip
Summary
Vi har udviklet en mikrofluidic platform for hurtig antibiotika modtagelighed test. Væske overføres ved høje hastigheder over bakterier immobiliseret på bunden af en mikrofluidic kanal. I nærværelse af stress og antibiotika dør modtagelige bakteriestammer hurtigt. Men, resistente bakterier kan overleve disse stressende forhold.
Abstract
Vi har udviklet en hurtig mikrofluidic metode til antibiotika modtagelighed test i et stress-baseret miljø. Væske overføres ved høje hastigheder over bakterier immobiliseret på bunden af en mikrofluidic kanal. I nærværelse af stress og antibiotika dør modtagelige bakteriestammer hurtigt. Men resistente bakterier overleve disse stressende forhold. Hypotesen bag denne metode er ny: stressaktivering af biokemiske veje, som er mål for antibiotika, kan fremskynde antibiotikafølsomhedstest. Sammenlignet med standard antibiotika modtagelighed testmetoder, den sats-begrænsende trin – bakteriel vækst – er udeladt under antibiotika ansøgning. Den tekniske gennemførelse af metoden er i en kombination af standardteknikker og innovative tilgange. Standarddelene af metoden omfatter bakteriekulturprotokoller, definition af mikrofluidiske kanaler i polydimethylsiloxan (PDMS), cellelevedygtighedsovervågning med fluorescens og batchbilledbehandling til bakterietælling. Innovative dele af metoden er i brugen af kultur medier flow til mekanisk stress anvendelse, brug af enzymer til at beskadige, men ikke dræbe bakterier, og brug af microarray substrater til bakteriel fastgørelse. Den udviklede platform kan bruges i antibiotika og nonantibiotiske relaterede lægemidler udvikling og test. Sammenlignet med standard bakterielle suspension eksperimenter, effekten af lægemidlet kan tændes og slukkes gentagne gange over kontrollerede tidsperioder. Gentagen observation af den samme bakteriepopulation er mulig i løbet af det samme eksperiment.
Introduction
Stigningen i bakteriel resistens intensiverer behovet for hurtige fænotypebaserede antibiotikafølsomhedstest for at beskytte vores lægemidler i sidste instans. Standard susceptibilitetstest er baseret på bakteriel væksthæmning i nærværelse af antibiotika, der tager flere (8-24) timer at gennemføre. Vi har udviklet en ny antibiotika modtagelighed test på en mikrofluidic platform, der er afhængig af stress-aktivering af biosyntetiske veje til at fremskynde virkningen af antibiotika.
Antibiotikafølsomhedstest på mikrofluidisk skala har den fordel, at de anvendes effektivt, da de kræver et lille antal bakterier. Derudover kan mikrofluidiske enheder multixeres for at teste flere prøver under flere forhold1,2. For nylig er en række mikrofluidiske metoder til antibiotikafølsomhedstest blevet rapporteret3-9. I disse metoder dyrkes bakterier inde i nano- og picoliterdråber3,7, i det fulde volumen af den mikrofluidiske kanal4-6,8, eller som enkelte bakterier elektrisk lokaliseret til bunden af kanalen9. Selvom disse test udføres i mikrofluidiske kanaler, overvåger de alle mikrobiel vækst i tilstedeværelsen og fraværet af antibiotika svarende til traditionelle metoder. Vækstmålinger foretages via optisk tæthed, pH-følsomme farvestoffer eller lyse felt-/fasekontrast- eller fluorescensbilleder. Selvom nogle af disse tests er hurtigere end traditionelle metoder, detekterer de hver især passivt antibiotikaresistens. Med andre ord kræver disse metoder stadig, at brugeren venter på bakterievækst som den endelige udlæsning.
I modsætning hertil har vi udviklet en metode, der bruger en kombination af forskydning og enzymatisk stress til at aktivere antibiotikafølsomme biokemiske veje10. Udfordrende stressede bakterier med disse antibiotika skaber en hurtigere modtagelighed test. Bakterier, der er resistente over for antibiotika er i stand til at modstå de stressende forhold. Modtagelige bakterier dræbes på den anden side hurtigt af de kombinerede belastninger. Procentdelen af celledød efter en time, målt ved mikroskopi ved hjælp af en fluorescerende død celleplet, definerer bakteriernes fænotype (resistent vs. modtagelig).
For en vellykket implementering af vores metode skal bakterier immobiliseres på bundoverfladen af den mikrofluidiske kanal. På denne måde kan bakterier udsættes for forskellige belastninger og samtidig afbildes under et mikroskop i et enkelt plan. En belagt mikroskop glas dias bruges til bakterier immobilisering. Rutsjebanen er forlakeret af producenten med epoxidgrupper til uspecifik proteinbinding. Den uspecifikke binding af disse epoxider til bakterielle overfladeproteiner fastgøre kovalent bakterierne til diasoverfladen.
Stammer testes under identiske forhold (forskydning + enzymatisk stress) i fravær (kontrol) og tilstedeværelse (eksperiment) af antibiotika. Fasekontrast og fluorescensmikroskopbilleder af hver kanal tages automatisk hvert andet minut i en time. Resistensbetegnelser foretages derefter ved at sammenligne procentdelen af døde bakterier i den eksperimentelle kanal med dem, der er til stede i kontrolkanalen. Efter en time anses en prøve med en celledødsprocent på over 1% for at være modtagelig, mens mindre end 0,5% død er tegn på resistens. Procenter, der falder mellem disse to afskæringer, betragtes som ubestemte, og prøven skal testes igen.
Mikrofluidiske kanaler defineres i PDMS, som er et materiale efter eget valg for mikrofluidiske enheder11. PDMS er optisk gennemsigtigt i en lang række bølgelængder, biokompatible, inerte, gennemtrængelige for gasser og har lav permeabilitet over for væsker. derfor er det velegnet til disse eksperimenter.
Mekanisk /forskydningsstress skabes af strømmen af rumtemperaturmedier over de immobiliserede bakterier. (Bemærk: Opvarmning af mediet til 37 °C har ingen væsentlig indvirkning på analysens resultat.) Automatiserede sprøjtepumper tvinger medier (indeholdende død celleplet +/- antibiotikum samt valgfrie enzymatiske stressorer) gennem de mikrofluidiske kanaler (200 μm x 400 μm) med en strømningshastighed på 1 ml/min for at give 6,25 kPa for forskydningskraft eller en forskydningshastighed på 6.000 sek.-1. Denne sats er lig med eller overstiger tidligere studerede forskydningsspændinger på Staphylococci.
Enzymet lysostaphin blev udvalgt til indledende eksperimenter, fordi det forårsager direkte skade på Staphylococcus cellevæggen. Koncentrationen af lysostaphin (0,7 ng/ml) var tilstrækkelig til at forårsage bakteriel cellevægsskade, men ikke tilstrækkelig til at forårsage bakteriecelledød uden antibiotika inden for forsøgets tidsramme. Lysostaphin er ikke nødvendig for den korrekte betegnelse af bakteriel modtagelighed, men det øger resultatet, hvilket fører til øget celledød i modtagelige stammer. I modsætning hertil er forskydningsstress afgørende for analysens funktion. Når methicillinfølsomme Staphylococcus aureus-stammer behandles med lysostaphin og oxacillin uden flow, registreres der ingen celledød i løbet af forsøget.
Celle levedygtighed overvåges med en fluorescerende død celle plet12. Udvælgelsen af farvestoffet var baseret på dets evne til selektivt at plette kun beskadigede celler, dets manglendetoksicitet for levende celler og dets lave baggrundsfluorescens, som gjorde det muligt for dets direkte tilføjelse til cellemediet uden yderligere trin. Valget af en fluorescerende farvestofkoncentration på 0,25 μM var at opnå acceptable signalniveauer i løbet af en 1,6 sek eksponeringstid for fluorescens excitationslys.
Beta-lactam, oxacillin, blev brugt i vores indledende undersøgelser. Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) arter er resistente over for oxacillin og vil ikke vise nogen mærkbar celledød i tidsrammen for forsøget. Koncentrationen på 50 μg/ml blev bestemt i de indledende undersøgelser. Lavere koncentrationer af antibiotika gav mindre adskillelse mellem resistente og modtagelige stammer, mens højere koncentrationer ikke forårsagede en mærkbar forskel i eksperimentelle resultater.
Vi har tidligere rapporteret om den vellykkede udvikling af en test, der kombinerer mekaniske og enzymatiske belastninger, der direkte påvirker bakteriecellevæggen13 med et antibiotikum, der hæmmer cellevægbiosyntese14,15. Disse principielle forsøg blev udført i et panel af MRSA og mødtes med en sikkerhedsfølsom S. aureus (MSSA). Men med udvælgelsen af ordentlige eksperimentelle parametre, bør vores metode gælder for flere arter af bakterier og flere klasser af antibiotika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol blev valideret og optimeret i et sæt eksperimenter med methicillin-følsomme og methicillin-resistente Staphylococcus aureus stammer10. Derfor bør denne protokol uden ændringer være direkte anvendelig for andre stammer af S. aureus og andre antibiotika med virkningsmekanismer, der påvirker bakteriecellevæggens biosyntese. Andre bakterietyper end S. aureus kan kræve variation i stressparametrene: opløselige (enzymatiske) og mekaniske belastninger. Hv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker ingeniører og studerende på Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. For at hjælpe med design, bearbejdning og automatisering af det eksperimentelle system takker vi Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin og Dr. Sudong Shu. Vi takker Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu og Katarzyna Kuliga for hjælp til at teste eksperimentelle protokoller og dataindsamling. Vi anerkender Dr. Anne E. Carpenter og Mark-Anthony Bray fra Imaging Platform på Broad Institute of Harvard og MIT for at få hjælp til udvikling af billedanalyserutinen i CellProfiler. Det beskrevne projekt blev delvist støttet af Awards R21AI079474 og 1R01AI101446 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases eller National Institutes of Health. Projektet blev også støttet af Fraunhofer USA.
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
Riferimenti
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
