Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Summary

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Abstract

Newcastle disease virus (NDV), het prototype lid van de Avulavirus geslacht van de familie Paramyxoviridae ^1, is een niet-gesegmenteerde negatieve-sense, enkelstrengs, omhuld RNA-virus (Figuur 1) met potentiële toepassingen als vector voor vaccinatie en behandeling van menselijke ziekten. Een grondige verkenning van deze toepassingen is pas na de oprichting van reverse genetics technieken om recombinante virussen van plasmiden die hun volledige genoom als cDNA ^2-5 te redden mogelijk geworden. Virale cDNA kan gemakkelijk worden gemodificeerd in vitro met gebruikmaking van standaard klonering procedures om het genotype van het virus te veranderen en / of nieuwe transcriptie-eenheden omvatten. Redding van dergelijke genetisch gemodificeerde virussen een waardevol hulpmiddel om factoren die verschillende stadia van de infectie, en maakt de ontwikkeling en verbetering van vectoren voor de expressie en afgifte van antigenen begrijpenvoor vaccinatie en therapie. Hier beschrijven we een protocol voor de redding van recombinant NDVs.

Introduction

Newcastle Disease Virus (NDV), een aviaire paramyxovirus die behoren tot het genus Avulavirus ^1, is een economisch relevant en dus op grote schaal onderzocht en bewaakt zoönoseverwekker, die ernstig kan beïnvloeden pluimveehouderij over de hele wereld. Hoewel het niet een menselijk pathogeen, NDV is ook grondig bestudeerd buiten het veld dierenarts zowel als model paramyxovirus en vanwege zijn zeer interessant, natuurlijke oncolytic eigenschappen ^6. Onderzoek naar NDV sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van reverse genetics technieken voor enkelstrengs, niet-gesegmenteerde negatieve-sense RNA-virussen, voor het eerst beschreven voor hondsdolheid virus door Conzelmann en coleagues ^2. Een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde NDVs, dragen vreemde genen of aanpassingen van hun wild-type genoom zijn uitgebreid bestudeerd sinds die tijd. Werken met deze recombinante virussen is cruciaal geweest om verschillende virulentiefactoren karakteriseren niet alleen van NDV, maar ook van andere relevante human ziekteverwekkers zoals influenza A virus ⁷ – of de opkomende Nipah virus ^8. Voorts zijn verschillende studies het gebruik van deze technieken voor de aangeboren antitumorale activiteit van NDV ^6,9,10 verbeteren, meestal door het verbeteren van de immunostimulerende eigenschappen van het virus onderzocht. Andere betrokken onderzoeksgebied op recombinante NDVs heeft de generatie van kandidaat-vaccins tegen andere virale ziekten zoals influenza geweest ^{5,11,12, 13} HIV, mazelen ^14, SARS ¹⁵ of dat door de respiratoire sincytial virus (RSV) ^16. Tussen de verschillende opmerkelijke voordelen van NDV zijn het gebrek aan reeds bestaande immuniteit in humane populaties, de stabiliteit van het vreemde genetische inserts, weinig recombinatory activiteit en de hoge veiligheidsprofiel combinatie met de bovengenoemde natuurlijke immunostimulerende eigenschappen ^17. Opvallend is ook het potentiële gebruik van recombinant bivalente vaccins in poultry, beschermend tegen zowel NDV en hoogpathogene aviaire influenza virussen ^11,12. Dit kan een uitstekende manier om de kansen van de laatste verspreiding van wilde naar gedomesticeerde dieren, ook als bijdrage aan een mogelijke inter-specifieke sprong van de gevreesde vogelgriep bij de mens te voorkomen te verminderen zijn. Ten slotte heeft reporter expressie NDV gebruikt voor de evaluatie van aangeboren immuunresponsen evenals de identificatie van interferon antagonist gecodeerd door meerdere virussen ^18-27.

Het proces van terugwinning van een recombinant, niet-gesegmenteerde negatieve RNA virus bestaat hoofdzakelijk op kunstmatig dwingen een virale replicatiecyclus in een producerende cel door transfectie van cDNA dat codeert voor de minimale infectieuze moleculaire machinerie, bekend als ribonucleoproteïne of RNP (figuur 2). De RNP's bestaan ​​uit het virale polymerase (P en L eiwitten), de nucleoproteïne (NP) en de volledige lengte antigenoom RNA van het virus. Dit RNA + antigenoom the template nodig voor het genereren van de complementaire RNA-genomen, die ook samen met de rest van de eiwitten van het virale RNP, recapituleert hetzelfde infectieuze complex dat een natuurlijk virus zou vrijgeven aan het cytoplasma van de cel na infectie (Figuur 2A ). Vanaf deze stap verder, kan de virale cyclus natuurlijk doorgaan en recombinante virions, inkapselen de gemodificeerde genomen, worden gegenereerd (Figuur 2B). Opmerkelijk, transfectie van de genomische cDNA in plaats van het antigenome cDNA sterk vermindert of volledig afschaft redding efficiëntie ^2,28-30. Zelfs wanneer antigenome cDNA getransfecteerd, de efficiëntie van de inkapseling van recombinante RNA in RNP's in getransfecteerde cellen is waarschijnlijk erg laag. Hierdoor redding protocollen voor NDV bevatten vaak verschillende stappen voor de amplificatie van het aantal virale deeltjes die vrijkomen uit de oorspronkelijk getransfecteerde cellen door coculturing hen permissieve cellen en / of deinfectie van bebroede eieren.

Vóór de redding, kan het cDNA worden gemanipuleerd met standaard kloneringswerkwijzen om de gewenste wijzigingen genereren. Hoewel specifieke mutaties van de verschillende genproducten en regulerende sequenties van het virus onomwonden worden bereikt Zo veel gepubliceerde werk recombinant NDV is de toevoeging van een nieuwe transcriptie-eenheid vereist in het NDV genoom. Net als andere leden van de familie paramyxovirus, het NDV-genoom codeert acht verschillende eiwitten in zes transcriptionele eenheden die differentieel uitgedrukt afhankelijk van hun locatie ten opzichte van het 3'-uiteinde in een dalende helling kritiek voor de virale levenscyclus ^1. Hierdoor moet de locatie van de nieuwe transcriptie-eenheid in het genoom zorgvuldig worden gekozen om een ​​evenwicht tussen expressie van het transgen en aantasting van virale replicatie te bereiken. Insertie van P en M-genen is het meest gebruikt, though andere sites zijn ook getest ^13,31.

Ongeacht het inzetstuk, het klonen in NDV-cDNA moet een aantal regels om een ​​rescuable construct gegenereerd: (i) nieuwe gen worden opgenomen in de NDV-genoom onder controle van de geschikte signalen voor het virale RNA-afhankelijke RNA polymerase. Deze sequenties moeten stroomopwaarts van de nieuwe open leesraam (ORF) worden toegevoegd zodat de polymerase kan het einde van de vorige gen (GE) en het begin van de nieuwe transgen (GS) herkent, gescheiden door een nucleotide sequentie intergene (IG) . Toevoeging van een geldige Kozak (K) sequentie eukaryotische ribosomale translatie verbeteren wordt ook aanbevolen voor een betere vreemde eiwit expressie ^32, (ii) de efficiënte replicatie van NDV, zoals voor de meeste leden van de familie Paramyxoviridae, is afhankelijk van de lengte genoom wordt veelvoud zes ^33, daarom elke inbrengen in de NDV heeft deze "regel van zes" te volgen. Eventueel required extra nucleotiden kunnen stroomafwaarts worden toegevoegd de nieuwe ORF, en (iii) de volgorde van de transgen moet worden gecontroleerd om te vinden mogelijke GE en GS achtige sequenties die redding efficiëntie, transgene expressie en / of levensvatbaarheid virus zou kunnen schaden. Indien aanwezig moet deze sequenties worden verwijderd door stille mutagenese. Het genereren van recombinant volledige lengte cDNA volgende genoemde regels is de eerste stap om efficiënt produceren genetisch gemodificeerde NDV zoals hier beschreven.

In het systeem alle DNA constructen onder controle van de T7 RNA polymerase promoter (Figuur 3). Deze cytoplasmatische polymerase in trans door co-infectie met een recombinant gemodificeerd Vaccinia Ankara virus (MVA-T7) ^34. Figuur 3A tonen de pNDV-B1 plasmide, dat de volledige lengte antigenome cDNA ⁵ codeert. Figuur 3B toont pTM1 plasmiden die NP, P en L ORF. Plasmiden pCITE-GFP, dat codeert, under de T7-promoter, het Green Fluorescent Protein (GFP) en pCAGGS GFP ^18, die dezelfde ORF codeert onder de kippen beta-actine promotor ^35, worden gebruikt als controles. In dit protocol tonen we de procedure te redden recombinant NDV uit het cDNA van de lentogene NDV-stam Hitchner B1 ⁵ (figuur 4).

Protocol

1. Bereiding van zoogdiercellen (Figuur 4A, dag 1) Split HEp-2-cellen of A549 de dag voor transfectie in platen met 6 putjes. Dichtheid van de cellen moet 80-90% confluentie bereikt de volgende dag. Meestal kan een confluente 100 mm schaal worden verdeeld in 8 putjes (ongeveer 1 x 10 6 cellen per well). Voor elk virus worden gered, moet 2-4 verschillende bronnen zijn mogelijk en 2 extra bronnen voor de besturing pCAGGS-GFP en pCITE-GFP 18, gericht op tran…

Representative Results

Redding van NDV is een gevestigde procedure routinematig uitgevoerd in laboratoria die toegang tot de volledige cDNA van het virus. De intrinsieke stochastische aard van de methode maakt het moeilijk om 100% rescue efficiëntie. Controle op de eerste stappen van de werkwijze, speciaal de transfectie-efficiëntie en infectie met MVA-T7, helpt mogelijke problemen. Figuur 5A toont standaard transfectie en transfectie / infectie-efficiënties die genoeg om succesvol NDV redding zijn identificeren. Na het ro…

Discussion

Verschillende factoren moeten worden beschouwd om goede resultaten te bereiken, terwijl het redden van NDV. Ten eerste, de volledige lengte cDNA construct voor gebruik moet worden ontworpen om de functionele integratie van de nieuwe transgenen / wijzigingen in het NDV genoom toestaan. Dat betekent, zoals hierboven vermeld, dat (i) geschikte gen uiteinde (GE), intergene (IG) en gen start (GS) sequentie worden toegevoegd indien nodig, (ii) er zijn geen vermeende GE of GS sequenties in de vreemde gen, en (iii) de volledige…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.