Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Summary

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

Abstract

Newcastle-Disease-Virus (NDV), dem Prototyp Mitglied der Avulavirus Gattung der Familie Paramyxoviridae ^1, ist ein nicht-segmentierten Negativ-Sense-Einzelstrang, umhülltes RNA-Virus (Abbildung 1) mit potentiellen Anwendungen als Vektor zur Impfung und Behandlung von menschlichen Krankheiten. In eingehende Erforschung dieser Anwendungen hat erst nach der Gründung der reversen Genetik Techniken, um rekombinante Viren aus Plasmiden ihre vollständige Genome als cDNA ^2-5 kodiert möglich zu retten. Virale cDNA bequem in vitro unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren, um den Genotyp des Virus zu verändern und / oder neue Transkriptionseinheiten modifiziert werden. Rettung von genetisch modifizierten Viren stellt ein wertvolles Werkzeug, um Faktoren, die mehrere Stadien der Infektion, sowie ermöglicht die Entwicklung und Verbesserung von Vektoren für die Expression von Antigenen und Liefer verstehenImpfung und Therapie. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Rettung von rekombinanten NDVs.

Introduction

Newcastle Disease Virus (NDV), ein Vogel-Paramyxovirus zu der Gattung Avulavirus ¹ gehört, ist eine wirtschaftlich relevante und damit weit erforscht und überwachten Zoonoseerreger, die schwerwiegende Auswirkungen auf die Geflügelzucht in der ganzen Welt. Obwohl nicht ein menschlicher Krankheitserreger, NDV wurde auch gründlich über den Tierarzt Feld sowohl als Modell Paramyxovirus und aufgrund seiner höchst interessanten, Natur onkolytischen Eigenschaften ⁶ untersucht. Forschung auf NDV stark von der Entwicklung der Techniken reverser Genetik für einzelsträngige, nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren, zunächst für Tollwutvirus von Conzelmann und coleagues ² beschrieben profitiert. Eine Vielzahl von gentechnisch veränderten NDVs, Trage fremde Gene oder Änderungen ihrer Wildtyp-Genoms wurden weitgehend seit sucht. Die Arbeit mit diesen rekombinanten Viren war entscheidend für verschiedene Virulenzfaktoren nicht nur von NDV, sondern auch von anderen relevanten huma charakterisierenn Krankheitserreger wie Influenza-A-Virus ⁷ – oder ⁸ emergent Nipah-Virus. Weiterhin wurden eine Reihe von verschiedenen Studien die Verwendung dieser Techniken, um die Antitumoraktivität von angeborenen NDV ^6,9,10 verbessern, vor allem durch die Verstärkung der immunstimulierenden Eigenschaften des Virus untersucht. Andere relevante Bereich der Forschung auf rekombinante NDVs war die Erzeugung von Impfstoffkandidaten gegen andere Viruserkrankungen, wie Influenza ^{5,11,12, 13} HIV, Masern ^14, SARS ¹⁵ oder die durch die Atem sincytial Virus (RSV) ¹⁶ verursacht wird. Unter den verschiedenen bemerkenswerten Vorteile, die durch NDV bereitgestellt sind der Mangel an bereits existierenden Immunität in menschlichen Populationen, die Stabilität der fremden genetischen Einsätze, einen rekombinatorischen Mangel an Aktivität und einer hohen Gesamtwirkungsprofil in Kombination mit den zuvor genannten natürlichen immunstimulierenden Eigenschaften ^17. Es ist auch bemerkenswert, die mögliche Verwendung von rekombinanten Impfstoffen in bivalenten poultry, Schutz sowohl gegen NDV und hochpathogene aviäre Influenzaviren ^11,12. Dies kann eine hervorragende Möglichkeit, um die Chancen des letzteren Verbreitung von wild bis domestizierte Tiere, also auch helfen, eine mögliche interspezifische Sprung der gefürchteten Vogelgrippe auf den Menschen zu verhindern, zu verringern. Schließlich Reportergen exprimierenden NDV Zur Beurteilung der angeborenen Immunantwort sowie der Identifizierung von Interferon-Antagonist durch mehrere Viren codiert ^18-27 verwendet.

Das Rettungsverfahren eines rekombinanten, nicht-segmentierten, besteht Negativstrang-RNA-Virus im wesentlichen zu erzwingen künstlich einen viralen Replikationszyklus in einer erzeugenden Zelle durch Transfektion von cDNA, die die minimale infektiöse molekulare Maschinerie, wie Ribonukleoprotein oder RNP bekannt (Fig. 2) codiert. Die RNPs aus der viralen Polymerase (P-und L-Proteine), das Nucleoprotein (NP) und das Volllängen-antigenomischen RNA des Virus. Diese RNA + Anti ist thzur Erzeugung der komplementären RNA-Genomen, die auch mit dem Rest der Proteine ​​der viralen RNP erforderliche zugehörigen E-Vorlage, rekapituliert die gleiche Infektionskomplex eine natürliche Virus würde auf das Zytoplasma der Zelle nach der Infektion (Fig. 2A frei ). Von diesem Schritt ab, kann das virale Zyklus selbst fort und rekombinanten Virionen enkapsidieren die modifizierten Genom, erzeugt (Fig. 2B). Bemerkenswert ist, Transfektion der genomischen cDNA anstelle der cDNA antigenomische stark beeinträchtigt oder ganz abschafft Rettungs Effizienz ^2,28-30. Selbst wenn antigenomischen cDNA transfiziert ist die Effizienz der Einkapselung der rekombinanten RNA in RNPs in transfizierten Zellen vermutlich sehr gering. Dadurch Rettungs Protokolle für NDV umfassen häufig verschiedene Schritte zur Amplifikation der wenigen Viruspartikel von den ursprünglich transfizierten Zellen durch Co-Kultivierung mit ihnen permissiven Zellen und / oder das freiInfektion von bebrüteten Eiern.

Vor der Rettungs kann die cDNA durch Standard Klonierungsverfahren, um die gewünschten Änderungen erzeugen manipuliert werden. Während spezifische Mutationen der verschiedenen Genprodukte und regulatorischen Sequenzen des Virus kann ohne weiteres auf diese Weise erreicht werden kann, hat viele der veröffentlichten Arbeiten mit rekombinanten NDV das Hinzufügen einer neuen Transkriptionseinheit in das NDV-Genoms erforderlich ist. Wie andere Mitglieder der Familie der Paramyxoviren, kodiert die NDV Genom acht verschiedene Proteine ​​in sechs Transkriptionseinheiten, die differentiell exprimiert werden je nach ihrer Lage in Bezug auf das 3'-Ende in einer abnehmenden Gradienten kritisch für den viralen Lebenszyklus ^ein. Aus diesem Grund muss die Lage des neuen Transkriptionseinheit, innerhalb des Genoms sorgfältig ausgewählt werden, um ein Gleichgewicht zwischen der Expression des Transgens und die Beeinträchtigung der viralen Replikation zu erreichen. Einsetzen zwischen P-und M-Gene verwendet wurde den meisten, though anderen Websites wurden ebenfalls getestet ^13,31.

Was auch immer der Einsatz, die Klonierung in NDV cDNA muss einige Regeln zu befolgen, um eine rescuable Konstrukt zu generieren: (i) ein neues Gen in das Genom NDV aufgenommen werden muss unter der Kontrolle der entsprechenden Signale für die virale RNA-abhängigen RNA-sein Polymerase. Diese Sequenzen sind stromaufwärts des neuen offenen Leserahmen (ORF) zugegeben werden, so kann die Polymerase das Ende der vorherigen Gen (GE) und dem Beginn des neuen Transgen (GS) zu erkennen, um ein einziges Nukleotid intergenischen Sequenz (IG) beabstandet . Zugabe eines gültigen Kozak (K)-Sequenz an eukaryontische Ribosomen Übersetzung zu verbessern, wird auch eine bessere Fremdproteinexpression ³² empfohlen, (ii) eine effiziente Replikation von NDV, wie für die meisten Mitglieder der Familie Paramyxoviridae, ist abhängig von der Genomlänge, die ein mehr von sechs ^33, daher das Einstecken in die NDV hat, um dieses "rule of six" zu folgen. Wenn nötig, required zusätzliche Nukleotide stromabwärts des ORF neue hinzugefügt werden, und (iii) die Sequenz des Transgens überprüft werden, um zu finden möglich GE und GS wie Rettungssequenzen, die Effizienz, die Transgen-Expression und / oder die Lebensfähigkeit des Virus beeinträchtigt. Falls vorhanden, müssen diese Sequenzen durch stille Mutagenese entfernt werden. Die Erzeugung von rekombinanten cDNA voller Länge folgenden genannten Regeln ist der erste Schritt, um effizient zu produzieren, eine genetisch modifizierte NDV wie hier beschrieben.

In dem System sind alle DNA-Konstrukte unter der Kontrolle des T7-RNA-Polymerase-Promotor (Fig. 3). Das Zytoplasma-Polymerase in trans durch Koinfektion mit einem rekombinanten Vaccinia Ankara Virus verändert (MVA-T7) ³⁴ vorgesehen. 3A zeigen die pNDV-B1 Plasmid, das in voller Länge cDNA antigenomische ⁵ kodiert. 3B zeigt pTM1 Plasmide NP kodiert, P und L ORFs. Plasmide pCITE-GFP, die codiert, under der T7-Promotor, dem Green Fluorescent Protein (GFP) und GFP pCAGGS ^18, die die gleiche ORF unter dem Huhn beta-Aktin-Promotor ³⁵ kodiert werden als Kontrollen verwendet. In diesem Protokoll zeigen wir das Verfahren zur rekombinanten NDV aus der cDNA der lentogenen NDV-Stamm Hitchner B1 ⁵ (Abbildung 4) zu retten.

Protocol

1. Herstellung von Säugerzellen (4A, Tag 1) Split HEp-2-Zellen oder A549 am Tag vor der Transfektion in 6-Well-Platten. Dichte der Zellen sollte 80-90% Konfluenz am nächsten Tag zu erreichen. Normalerweise kann eine konfluente 100-mm-Schale in 8 Vertiefungen aufgeteilt werden (ca. 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung). Für jedes Virus, gerettet zu werden, sollte 2-4 verschiedenen Vertiefungen enthalten sein, sowie 2 zusätzliche Bohrungen für die Kontrollen pCAGGS-GFP und GFP-pCITE <s…

Representative Results

Rettung von NDV ist ein gut etabliertes Verfahren, die routinemäßig in den Laboratorien, die den Zugriff auf die vollständige cDNA des Virus durchgeführt. Die intrinsische stochastischen Natur des Verfahrens macht es jedoch schwierig, 100% Rettungseffizienz. Die Überwachung der frühen Schritte des Prozesses, speziell die Transfektionseffizienz und die Infektion mit MVA-T7, hilft, mögliche Probleme. 5A zeigt Standard-Transfektion und Transfektion / Infektion Wirkungsgrade, die genug für einen erf…

Discussion

Mehrere Faktoren sind zu berücksichtigen, um gute Ergebnisse zu erzielen, während die Rettung NDV werden. Zuerst wird die Volllängen-cDNA-Konstrukt verwendet werden muss, ausgelegt werden, um die funktionelle Einbindung der neuen Transgene / Änderungen in dem NDV-Genom zu ermöglichen. Dies bedeutet, wie oben angegeben, dass (i) entsprechende Gen Ende (GE), intergenen (IG) und Gen-Start (GS)-Sequenzen hinzugefügt werden, falls erforderlich, (ii) es gibt keine mutmaßlichen GE oder GS-Sequenzen in das Fremd Gen, und…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.