Produzione e purificazione di vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 non replicativo

Summary

Negli ultimi 15 anni, i vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) hanno dimostrato la loro efficienza nel trasdurre cellule in vitro e in vivo e sono ampiamente utilizzati per la vaccinazione e la terapia genica. Qui descriviamo una procedura per costruire, produrre e purificare vettori CAV2, dando origine a sospensioni virali ad alto titolo.

Abstract

I vettori derivati dall'adenovirus (Ad) sono stati ampiamente utilizzati per il trasferimento genico a breve o lungo termine, sia per la terapia genica che per le applicazioni vaccinali. A causa della frequente immunità preesistente contro l'adenovirus umano di tipo 5 di uso classico, l'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) è stato proposto come vettore alternativo per il trasferimento genico umano. La biologia ben caratterizzata di CAV2, insieme alla sua facilità di manipolazione genetica, offre importanti vantaggi, in particolare per il trasferimento genico nel sistema nervoso centrale, o per indurre un'ampia gamma di risposte immunitarie protettive, dall'immunità umorale a quella cellulare. Al giorno d'oggi, il CAV2 rappresenta uno degli adenovirus non umani più interessanti per l'uso come vettore di vaccini. Questo protocollo descrive un metodo semplice per costruire, produrre e titolare vettori CAV2 ricombinanti. Dopo aver clonato la cassetta di espressione del gene di interesse in un plasmide navetta, il plasmide genomico ricombinante viene ottenuto per ricombinazione omologa nel ceppo batterico di E. coli BJ5183. Il plasmide genomico risultante viene quindi trasfettato in cellule renali canine che esprimono i geni complementari CAV2-E1 (DK-E1). Un'amplificazione virale consente la produzione di un ampio stock virale, che viene purificato mediante ultracentrifugazione attraverso gradienti di cloruro di cesio e desalinizzato mediante dialisi. La sospensione virale risultante ha abitualmente un titolo di oltre^10-10 particelle infettive per ml e può essere somministrata direttamente in vivo.

Introduction

Negli ultimi decenni, i vettori derivati dagli adenovirus (Ads) hanno dimostrato la loro efficacia per la terapia genica e la vaccinazione, nonché nella viroterapia oncolitica ¹. Gli annunci sono virus icosaedrici senza involucro della famiglia degli Adenoviridae, che sono stati isolati da mammiferi, uccelli, rettili, anfibi e pesci. Dalla loro scoperta nel 1953, gli AD sono stati intensamente studiati come modelli per studiare le interazioni virus/cellula e, più recentemente, come sistemi di consegna genica basati su vettori ². In effetti, i vettori basati su ADS offrono molti vantaggi, come la loro ampia gamma di ospiti e una biologia ....

Protocol

1. Costruzione di un plasmide genomico CAV2 non replicativo

Nota: tutti i plasmidi descritti in questo protocollo sono stati descritti in precedenza⁷ e sono disponibili su richiesta.

1. Clonare il GOI nel plasmide pShuttle, utilizzando enzimi di restrizione appropriati, per generare pShuttle-GOI (Figura 1A).
2. Digerire 2 μg di pShuttle-GOI mediante AscI/PacI. La digestione rilascia il frammento Shuttle-GOI (~2,9 kbp + sequenza ORF GOI) dalla spina dorsale plasmidica (2,8 kbp).
3. Purificare il frammento Shuttle-GOI dopo l'elettroforesi su gel di a....

Results

La produzione di vettori CAV2 ricombinanti si basa su tecniche di biologia molecolare di base ma importanti. Prima della produzione di vettori virali, è infatti necessario costruire un genoma ricombinante di CAV2 che porti una cassetta di espressione per il transgene. Questa costruzione prevede due passaggi: in primo luogo, il gene di interesse (GOI) viene clonato in un plasmide navetta come cassetta di espressione (cioè con il promotore e il segnale di poliadenilazione). Questo elemento funzionale è affiancato .......

Discussion

Il semplice metodo qui descritto, adattato dalla ben documentata tecnologia Ad5, consente la produzione efficiente di vettori CAV2 non replicativi con una capacità di clonazione tipica di ~4,2 kbp. Per quanto riguarda le considerazioni temporali, un genoma CAV2 ricombinante viene solitamente generato in due settimane, mentre ci vorranno altre 5 settimane per amplificare, purificare e titolare le sospensioni virali.

Sebbene la produzione del primo lotto di vettori derivati da CAV2 possa sembrar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzimi di restrizione	New England Biolabs	Vari
kit di trasfezione Jet Prime	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli batteri BJ5183	Agilent	200154
PD-10	GE Healthcare	17-0851-01
EmeraldAmp polimerasi	Takara	RR320A
Kit di plasmidi nucleospin	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
Provette da 14 ml, Ultra Clear	Beckman	344060