セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

Summary

私たちは、生きた細胞内のギャップジャンクションを介しセルラー通信を可視化し、いくつかの有用なヒントを提供するために、ルシファーイエローの単一細胞マイクロインジェクションを実行する方法をここで説明します。我々は、この論文は誰もが機能的ギャップ結合による細胞結合の程度を評価するために役立つことを期待しています。ここで説明するすべてのものは、原理的には、1,000ダルトン未満の分子量を有する他の蛍光色素に適合させることができます。

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

ギャップ結合は、隣接セル¹間の相互通信を可能にする細胞間チャネルです。この通信は、それぞれの間のチャネルを形成するコネクソンまたはヘミチャネルと寄与する二つ以上の隣接セルを接続します。哺乳動物細胞において、コネクソンは6コネキシンは、4つの膜貫通ドメイン及び細胞質²内のC及びN末端でのモノマーにより形成されます。ギャップ結合は^、イオンのみ、第二メッセンジャーおよび小代謝産物の流れを許容するが、また、シナプス伝達、心臓の収縮、細胞の増殖および分化^{3、4、5、6}のような多くの生理学的プロセスにおいて、セルラー通信の多くの形態、に寄与しません^7,8。また、ギャップ結合が関連付けされています癌^9、10、筋萎縮症^11、いくつかの遺伝病や脱髄疾患¹²を含む多くの疾患。

細胞間のクロストークのこのタイプは、いくつかの方法^{13、14、15、16}により評価することができます。本稿では、生きた細胞のギャップジャンクションを介しセルラー通信を可視化するためにルシファーイエローの単一細胞マイクロインジェクションを実行する方法を示しています。我々は、細胞およびマイクロピペット、マイクロマニピュレータの使用法および胸腺上皮細胞株でルシファーイエロー染料の注入を準備する方法について説明します。通常、この実験手順は、染料でロードセルに接続されたセルの平均値で分析することができました。また、この方法は、ギャップ未満の分子量を有する他の蛍光色素で使用することができます接合は、カットオフ約1,000ダルトンです。

Protocol

細胞の調製胸腺上皮細胞株（IT76M1）または細胞の培養物を維持インキュベーターにおいて試験される（37℃/ 5％CO 2）。 PBS 1×（このアイテム3回繰り返す）で細胞を洗浄。 5分間細胞にトリプシンを追加します。 トリプシンおよび遠心分離（5分間800×gで）を有する細胞に10％FBS（ウシ胎児血清）と（項目1.3で追加されたトリプシンの体積の2回）培地を?…

Representative Results

これらの細胞は、43 21をコネキシンによって形成された機能的なギャップ結合を発現することが記載されたように、胸腺上皮細胞株IT-76MIは、ギャップ結合により色素の結合を評価しました。ピペットの先端の下に一つのセルに適用すると、図1は、ルシファーイエローの注入を示しています。数分後、接続されたセルは、ギャップ結合を介して蛍光色…

Discussion

細胞間のチャネルによって透過性が^16を必要としているが、機能的な細胞間ギャップ結合の存在、膜不透過性トレーサーの使用を確認するために。フルオレセイン、第一の蛍光色素は、細胞から細胞へのカップリング^22、非接合膜³との間に透過性であり、したがって、ルシファーイエロー染料¹⁵で置換されている観察しま…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.