Encelliga mikroinjektion för analys Cell Communication

Summary

Vi beskriver här hur man utför en enda cell mikroinjektion av Lucifer Yellow att visualisera cellulära kommunikation via gap-junctions i levande celler, och ger några användbara tips. Vi förväntar oss att detta dokument kommer att hjälpa alla att utvärdera graden av cellulär koppling på grund av funktionella gap-junctions. Allt som beskrivs här kan vara i princip anpassas till andra fluorescerande färgämnen med molekylvikt under 1000 Dalton.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Gap korsningar är inter kanaler som tillåter förbindelse bland angränsande celler ^1. Detta meddelande förbinder två eller flera angränsande celler, där var och en bidrar med en connexon eller hemichannel att bilda inter kanal. I däggdjursceller, är connexon bildas av sex connexiner, monomerer med fyra transmembrandomäner och en C och N-terminala inom cytoplasman ^2. Gap junctions inte bara tillåta flödet av joner, sekundära budbärare och små metaboliter, utan också bidra till många former av cellulär kommunikation i många fysiologiska processer, såsom synaptisk överföring, hjärtsammandragning, celltillväxt och differentiering ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Dessutom kanalförbindelser har associerats medmånga sjukdomar, bland annat cancer ^{9, 10,} muskelatrofi ^11, vissa genetiska sjukdomar och demyeliniserande sjukdomar ^12.

Denna typ av intercellulär överhörning kan utvärderas genom flera metoder ^{13, 14, 15, 16.} I detta dokument visar vi hur man utför en enkelcellmikroinjektion av Lucifer Yellow att visualisera cellulära kommunikation via gap-junctions i levande celler. Vi diskuterar hur man förbereder cellerna och mikropipett, användningen av mikromanipulator och injektion av Lucifer gult färgämne i en tymus epitelceller linje. Vanligtvis, kan detta försöksförfarande analyseras med genomsnittet av anslutna celler till cellen laddad med färgämne. Dessutom kan denna metod användas med andra fluorescerande färgämnen med molekylvikt under gapetkorsningar cut-off som är ca 1000 dalton.

Protocol

1. Framställning av celler Upprätthålla en kultur av en tymisk epitelcellinje (IT76M1) eller cell, som skall testas i en inkubator (37 ° C / 5% CO2). Tvätta cellerna med PBS 1x (upprepa denna punkt 3x). Lägg Trypsin till cellerna under 5 min. Lägg medium (två gånger av den mängd trypsin tillsätts i punkt 1.3) med 10% FBS (fetalt bovint serum) till cellerna med trypsin och centrifug (800 x g under 5 min). Räkna cellerna i en hemocytometer. </…

Representative Results

Tymus epitelcellinje IT-76MI användes för att utvärdera färg koppling genom gap junctions som dessa celler beskrevs för att uttrycka funktionella gap-junctions bildats genom connexin 43 21. Figur 1 visar injektions av Lucifer Yellow när den tillämpas i en cell nedanför spetsen på pipetten. Efter några minuter, kopplade celler blir fluorescerande (asterisker) som anger spridningen av det fluorescerande färgämnet genom kanalförbindelser. Antalet celler …

Discussion

För att kontrollera förekomsten av funktionella inter gap junction, användning av spårämnen, som är membran ogenomträngligt, men genomträngligt genom inter kanaler krävs ^16. Fluorescein, den första fluorescerande färg för att observera cell-till-cell-koppling ^22, är permeabel mellan icke junctionala membran ³ och har därför ersatts med Lucifer Yellow färgämne ^15. För närvarande, för att hitta det bästa va…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.