Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

Summary

Protein kropsbygning og dynamik er nøglen til at forstå forholdet mellem protein struktur og funktion. Hydrogen udveksling kombineret med høj opløsning massespektrometri er en alsidig metode til at studere de konformationelle dynamik proteiner samt karakterisering af protein-ligand-og protein-protein-interaktioner, herunder kontaktflader og allosteriske effekter.

Abstract

Alle cellulære processer, afhænger af funktionaliteten af ​​proteiner. Selvom funktionaliteten af ​​et givet protein er den direkte konsekvens af sin unikke aminosyresekvens, er den kun realiseres ved foldningen af ​​polypeptidkæden i en enkelt veldefineret tredimensionel arrangement eller mere almindeligt i et ensemble af interconverting konformationer. Undersøgelse af forbindelsen mellem protein kropsbygning og dets funktion er derfor afgørende for en fuldstændig forståelse af, hvordan proteiner er i stand til at opfylde deres store udvalg af opgaver. En mulighed for at studere konformationsændringer et protein gennemgår mens forløber gennem dets funktionelle cyklus er ^hydrogen-1 H / ² H-udveksling i kombination med høj opløsning massespektrometri (HX-MS). HX-MS er en alsidig og robust metode, der tilføjer en ny dimension til strukturel information fås ved f.eks crystallography. Det bruges til at studere proteinfoldning og udfoldning binding af små molecule ligander, protein-protein interaktioner, konformationsændringer tilknytning til enzymkatalyse og allostery. Desuden er HX-MS anvendes ofte, når mængden af ​​protein er meget begrænset eller krystallisation af proteinet ikke er mulig. Her giver vi en generel protokol for at studere protein dynamik med HX-MS og beskriver som et eksempel på, hvordan at afsløre samspillet grænseflade to proteiner i en kompleks.

Introduction

Antallet af krystalstrukturer af proteiner og protein komplekser steget kraftigt i de seneste år. De præsenterer uvurderlige snapshots af den strukturelle organisering af disse proteiner og skabe et grundlag for struktur-funktion analyse. Men dynamikken i proteiner og de konformationsændringer, som er afgørende for deres funktioner, er sjældent afsløret ved røntgenkrystallografi. Cryo-elektronmikroskopi på den anden side er i stand til at fange protein og protein-komplekser i forskellige konformationer, men generelt kan ikke løse konformationelle ændringer ned til sekundær struktur niveau ^1. Konformationelle dynamik af proteiner i opløsning ved atomare detaljer kan kun løses ved NMR, men denne metode er stadig begrænset til proteiner af relativt små størrelser (generelt ≤ 30 kDa) og har brug for høje koncentrationer af proteiner (≥ 100 mM), som hæmmer eksperimenter med oligomeriserende eller sammenlægning tilbøjelige proteiner ^2. En metode, derer i stand til at bygge bro mellem høj opløsning røntgenkrystallografi og cryo-elektronmikroskopi, og som ikke er begrænset af protein størrelse eller koncentration er amid ^hydrogen-1 H / ² H-exchange (HX) i kombination med massespektrometri (MS). I de senere år har denne metode udviklet til et værdifuldt analytisk værktøj til analyse af protein-dynamik, proteinfoldning, proteinstabilitet og konformationsændringer ^3-5. Den molekylære basis for denne metode er den labile karakter af backbone amide hydrogener i proteiner, som vil veksle med deuteriumatomer når proteinet er anbragt i en _D2O løsning. Den efterfølgende stigning i protein masse over tid måles med høj opløsning MS.

I korte ustrukturerede peptider HX afhænger kun af temperatur katalysator fusion (OH ^-, H ₃ O ⁺ dvs. pH, se figur 3) og kæder af tilstødende rester aminosyre side grundet induktiv, katalytic og steriske effekter. Disse virkninger på den iboende kemiske vekselkurs k _lm er elegant kvantificeret ved Bai et al. ⁶ og et program er til rådighed (udlånt Z. Zhang), som beregner k _lm for hver aminosyre i et polypeptid, afhængig af pH og temperatur. Ved neutral pH og omgivelsestemperaturer k _ch er i størrelsesordenen af 10 ¹ -10 ³ sek ^-1. I foldede proteiner kan HX være 2-9 størrelsesordener langsommere hovedsageligt på grund af hydrogenbinding i den sekundære struktur og i mindre grad på grund af begrænset adgang hydratiserede OH ^– ioner til det indre af en tæt foldet protein. HX i native proteiner implicerer derfor delvis eller global udfoldning, kemisk udveksling og refoldning til den oprindelige tilstand i henhold til ligning (1), og de ​​observerede valutakurser k _obs afhænger åbningen rate k _op, balancedagens kurs k _cl og den iboende kemisk udveksling rate k _ch ifølge ligning (2).

Under native state betingelser k _op er meget mindre end k _lm og kan ignoreres i nævneren. Der er to ekstreme valutakurser regimer kaldet EX1 og EX2. Hvis k _cl er meget mindre end k _lm (EX1) den observerede hastighed er praktisk taget lig med åbningen sats og HX giver umiddelbar iagttagelse af udfoldning af et konstruktionselement. En sådan udveksling regime, hvor alle amid protoner udveksling på en gang ved åbning af den strukturelle element, er umiddelbart kan opgøres i MS med en bimodal fordeling af isotoptoppe ^7. Hvis k _cl er meget større end k _lm (EX2) den observerede rente er proportional med k _ch hvorved proportionalitetskonstanten er lig med folde-udfoldning balancer konstant K _u = k _op </sub> / K _cl. Under disse betingelser, er mange åbning og lukning begivenheder er nødvendige, før alle amid protoner bytte for deuteroner, hvilket fører til en gradvis stigning i den gennemsnitlige masse, mens den isotopiske fordeling forbliver nogenlunde det samme. Den EX2 regime tillader bestemmelse af fri energi udfolde ΔG _u og dermed stabiliteten på et strukturelt element. Under oprindelige tilstand betingelse EX2 regime er mest almindelig. Forøgelse af pH og tilsætning af chaotrope midler kan flytte udvekslingen mekanisme til at EX1. Derfor kan HX-MS bruges til at udforske termodynamisk samt kinetiske parametre for proteinfoldning og konformationelle ændringer.

Som nævnt ovenfor HX er uløseligt pH og temperatur afhængig og udveksling halveringstid af en helt opløsningsmiddel udsat proton rygraden amidgruppen er mellem 5-400 msek ved fysiologisk pH (pH 7,6) og 30 ° C, men 10 min til> 15 timer med et gennemsnit på> 2 timer ved pH 2,9 og 0 °C (bortset fra proton første rygraden amidbinding af et polypeptid, som udveksler med en halveringstid på ca. 1-2 min.) Under sådanne langsom udveksle forhold er det muligt at fordøje prøven ved hjælp af proteaser (f.eks pepsin), som er aktiv under disse betingelser, med ud at miste alle de oplysninger, der findes i de inkorporerede deuteroner. Siden indførelsen af peptisk fordøjelse under langsomme udveksle forhold, kan ikke kun de samlede HX kinetik af proteiner i fuld længde analyseres men HX kan lokaliseres til bestemte regioner ^8,9. Rumlig opløsning øjeblikket er begrænset til størrelsen af ​​de peptiske fragmenter, hvilket er generelt mellem 10-30 rester. Overlappende fragmenter skabt på grund af den ikke-specifikke karakter af spaltning med pepsin, kan imidlertid føre til en stigning i rumlig opløsning. Desuden blev flere andre proteaser fundet at være aktive under quench betingelser dog langt mindre effektive end pepsin ^10. Yderligere increaSE for rumlig opløsning kan nås ved fragmentering af peptider i gasfasen ved metoder, der bevarede deutereringen mønster såsom indfangning af elektroner dissociation (ECD), elektron transfer dissociation (EBD) og infrarød multiphoton dissociation (IRMPD) ^11-13. Disse teknikker forhindre tab af rumlig opløsning på grund af intramolekylær proton migration ("scrambling"), som er observeret ved kollision-induceret dissociation (CID) den mest almindeligt anvendte fragmentering teknik. Men disse metoder kræver optimering for hvert enkelt peptid og er således stadig ganske udfordrende.

HX-MS er blevet anvendt til analyse af protein-ligand-og protein-protein-interaktioner, herunder virale capsid samlingen ^14-17. Proteinudfoldning og genfoldning såvel som temperatur inducerede konformationelle ændringer blev undersøgt ^7,18,19. Phosphorylering og enkelt aminosyremutation-relaterede konformationsændringer ^16,20 og nucleotide-inducerede ændringer blev analyseret ^21,22. Derfor er denne metode synes ideelt egnet til at analysere montage og dynamik molekylære maskiner. En attraktiv kandidat, hvis mekanisme er af stor almen interesse, er Hsp90 anstandsdame kompleks.

Protocol

1.. Forberedelse af buffere og proteinprøver Forbered H2O puffer. Brug Hsp90 standard buffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCI, 5 mM MgCl2, 10% glycerol), som H2O puffer. Bemærk: Hvis prøven blev dialyseret før analyse bruge dialysebufferen som H 2 O buffer. Det er vigtigt, at D2O puffer adskiller sig fra H2O puffer kun hydrogenisotopbygnings. Flygtige buffere som NH4 CO 3 eller NH4-ace…

Representative Results

Hsp90 er en molekylær chaperone i gær og medlem af Hsp90 anstandsdame familien. Ved at gå gennem en kompleks ATPase cyklus det hjælper sene folde trin af mange protein klienter. Effektiv foldning kræver overførsel af kunder fra Hsp70 og interaktion af co-chaperone Sti1/Hop. Sti1 binder direkte til Hsp90 og letter klient binding ved inhibering af Hsp90 er ATPase-aktivitet. Interaktion af Hsp90 med Sti1 nylig blev undersøgt ved hjælp af HX-MS 23. Her præsenterer vi repræsentative resultater for de und…

Discussion

Binding af et samspil partner til et protein uundgåeligt forårsager ændringer i tilgængelighed opløsningsmiddel på bindingssted. Derudover er der mange proteiner undergår dynamiske konformationsændringer ved binding, som påvirker andre regioner end den faktiske bindende interface. HX-MS er en robust metode til at overvåge disse ændringer og er endda i stand til at afsløre konformationsændringer i proteiner på tidsskalaer der andre metoder ikke kan dække.

For med held at udfør…

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator	Valco	#EPC6W
Injection valve (manual)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 media	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsin	Sigma	#P6887	use fresh pepsin
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
Tubing (various diameters)	IDEX
Fittings	IDEX	#PK-110 with PK-100