Mikroinjeksjon er en vanlig teknikk som brukes til å levere DNA-konstruksjoner, mRNAs, morfolino antisens-oligonukleotider eller andre behandlinger inn i egg, embryoer og celler av forskjellige arter.
Mikroinjeksjon inn i celler og embryoer er en vanlig teknikk som benyttes for å studere et bredt spekter av biologiske prosesser. I denne fremgangsmåten en liten mengde av behandlingsoppløsningen er lagt inn i en mikroinjeksjon nål som brukes for fysisk å injisere individuelle immobiliserte celler eller embryoer. Til tross for behovet for innledende opplæring for å utføre denne fremgangsmåten for high-throughput levering, mikroinjeksjon gir maksimal effektivitet og reproduserbar avgivelse av en lang rekke behandlingsløsninger (inkludert komplekse blandinger av prøvene) inn i celler, egg eller embryoer. Søknader til microinjections inkluderer levering av DNA-konstruksjoner, mRNA, rekombinante proteiner, gevinst på funksjon, og tap av funksjon reagenser. Fluorescent-eller kolorimetriske fargestoff tilsettes til den injiserte løsningen til å muliggjøre direkte visualisering av effektiv levering, samt et verktøy for pålitelig å normalisere mengden av avgitt løsning. Den beskrevne metoden gjør mikroinjeksjon av 100-400 kråkebolle zygotes innenfor 10-15 min.
Effektiv og reproduserbar behandling levering er en av de viktigste metodiske utfordringer for forskerne. Flere metoder har blitt etablert for å forbigående leverer renseløsninger inn i egg, embryo, og cellene. Disse metodene inkluderer elektroporering (basert på et genererer transiente porene i membranen ved hjelp av korte elektriske pulser) 1,2, lipofection (levering via fusjon av behandlings-holdige liposomer med membranen) 1, mikropartikkel bombardement 1 (DNA utfelles på micron -store metallpartikler som deretter brukes til å trenge inn i cellene ved høy hastighet), og transduksjon (virus benyttes som et leveringsmiddelet av transgener). For øyeblikket er mikroinjeksjon den eneste metode som har fordelen av å levere en hvilken som helst løsning med 100% effektivitet med minimale reagenser. Videre kan en enkelt injeksjon løsning være sammensatt av en kompleks blanding av behandlinger. Denne teknikken er blitt brukt til å vellykketly microinject egg og embryoer fra en rekke arter som kråkeboller 3,4, sebrafisk 5, mus 6, frosk 7, og storfe 8 samt enkeltceller i vevet kultur ni. Enkelt blastomeres injeksjoner med senere utviklingsstadier er også gjennomført 10-12.
De nåværende fremgangsmåter for microinjections er basert på trykk-injeksjonsfremgangsmåten som først ble beskrevet av Hiramoto 10, men har store fremskritt blitt gjort til optimalisering av prosessen. Utmerket mikroinjeksjon teknikker har blitt beskrevet andre steder 11, og her beskriver vi en av de spesifikke metoder som i dag benyttes til microinject kråkebolle (Strongylocentrotus purpuratus) nylig befruktede egg. I over et århundre, har kråkeboller vært en verdifull eksperimentell modell 15,16. Kråkeboller er evolusjonært nært knyttet til chordatar (inkludert oss) og analyse avderes genom avslørte at de inneholder alle de store gen familier som human 17. De produserer et stort antall synkront utvikle gjennomsiktig embryo som lett kan manipuleres. Ved hjelp av kråkebolle som modellorganisme, har kråkebollen samfunnet bidratt til vår forståelse av befruktning prosessen 18-21, cellebiologiske prosesser 22-24, og genet regulatoriske nettverk (GRNs) 25-28.
Mikroinjeksjon i kråkebolle zygotes krever flere trinn. Først eggene må være immobilisert før injeksjoner (beskrevet nedenfor). Mikroinjeksjon retter er belagt med protaminsulfat (PS), noe som skaper et positivt ladet overflate som de negativt ladede egg kan feste seg tre. Eggene dejellied ved inkubasjon i sur sjøvann (pH 5,15) i 10 min, etterfulgt av to vaskinger i naturlig sjøvann eller kunstig vann sjøen (pH 8,0). De dejellied eggene er nøye rodde i en rett linjei midten av PS belagt skål i nærvær av 1 mM 3-aminotriazole (3-AT), som er nødvendig for å inhibere aktiviteten av ovoperoxidase som utskilles fra kortikale granulater av egget som følge av befruktning 29. Dette trinnet er viktig for å hindre herding av befruktning konvolutt og legge til rette for mikroinjeksjon nål oppføring. Som et alternativ til 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic syre (PABA) benyttes. Injeksjonsoppløsningen blir lagt inn i en mikroinjeksjon nål ved hjelp av spesialiserte microloading pipettespissen og montert på en holder festet til mikromanipulator og trykkenheten (fig. 1). Hver nål kan brukes til å microinject individuelle zygoter i flere eksperimenter på forskjellige dager. Mikroinjeksjon kan utføres i 10-15 min til de zygotes stivne. De zygoter ble deretter vasket med saltvann og kultivert ved 15 ° C. Når embryoene nå klekking blastula scenen, slipper de klekking enzym som fordøyer deler av fertilization konvolutt 30 og tillate dem å naturlig løsne fra PS-belagt parabolen. Om nødvendig, kan embryoene bli forsiktig løsnet fra formen ved hjelp av et munn pipette eller Pasteur pipette ved forsiktig å blåse sjøvann mot embryoene. Den beskrevne metoden muliggjør effektiv og pålitelig mikroinjeksjon av 100-400 nylig befruktede egg på en enkelt rett, og gir en høy gjennomstrømming metode for nedstrøms analyser.
Mikroinjeksjon er en kraftfull teknikk for å levere ulike behandlinger som DNA, mRNA, rekombinante proteiner, tap av funksjon og forsterkning av funksjons reagenser, fargestoffer og deres kombinasjoner i egg, embryoer og celler av forskjellige organismer 1-7. Imidlertid bør flere hensyn tas i betraktning når man designer en mikroinjeksjon eksperiment.
Det er kritisk viktig å ta hensyn til løseligheten av den leverte behandling og injeksjonsvolumet. Dersom microinjected opplø…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Santiago Suarez for kritisk lesing av manuskriptet og Betty Cowgill for hjelp i fotografering. Vi takker også de anonyme anmeldere for sin kritiske tilbakemeldinger. Dette arbeidet støttes av Universitetet i Delaware forskningsfond.
Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |