Mikroinjektion är en vanlig teknik som används för att leverera DNA-konstruktioner, mRNAs, morfolino antisensoligonukleotider eller andra behandlingar in i ägg, embryon, och celler från olika arter.
Mikroinjektion in i celler och embryon är en vanlig teknik som används för att studera en mängd olika biologiska processer. I denna metod en liten mängd behandlingslösning laddas i en mikroinjektion nål som används för att fysiskt injicera enskilda immobiliserade celler eller embryon. Trots behovet av grundutbildning för att utföra den här proceduren för hög genomströmning leverans, erbjuder mikroinjektion maximal effektivitet och reproducerbar leverans av ett brett utbud av behandlingslösningar (inklusive komplexa blandningar av prover) i celler, ägg eller embryon. Ansökan till microinjections omfattar leverans av DNA-konstruktioner, mRNA, rekombinanta proteiner, vinst på funktion, och förlust av funktions reagenser. Lysrör eller kolorimetrisk färgämne tillsätts till den injicerade lösningen för att möjliggöra omedelbar visualisering av effektiv leverans samt verktyg för tillförlitlig normalisering av beloppet för den levererade lösningen. Den beskrivna metoden möjliggör mikroinjektion 100-400 sjöborre zygotes inom 10-15 min.
Effektiv och reproducerbar behandling leverans är en av de viktigaste metodologiska utmaningarna för forskare. Flera metoder har inrättats för att tillfälligt leverera behandlingslösningar i ägg, embryon och celler. Dessa metoder innefattar elektroporering (baserad på en genererande transienta porer i membranet med användning av korta elektriska pulser) 1,2, lipofektion (leveranstid genom fusion av behandling-innehållande liposomer med membranet) 1, mikropartikelbombardemang 1 (DNA utfälles på mikron stora metallpartiklar som sedan används för att tränga in i celler vid hög hastighet), och transduktion (viruset används som en tillförselvehikel av transgener). Just nu är mikroinjektion den enda metod som håller fördelen av att leverera en lösning med 100% effektivitet med minimal reagenser. Vidare kan en enda injektion lösning vara sammansatt av en komplex blandning av behandlingar. Denna teknik har använts för att framgångsriktly mikroinjicera ägg och embryon från många arter såsom sjöborrar 3,4, zebrafisk 5, mus 6, groda 7, och nötkreatur 8 samt enstaka celler i vävnadskultur 9. Enstaka blastomeres injektioner vid senare utvecklingsstadier har också genomförts 10-12.
De nuvarande metoderna för microinjections är baserade på tryckinjektionsmetod som ursprungligen beskrevs av Hiramoto 10, men har stora framsteg gjorts mot optimering av processen. Utmärkta mikroinjektion tekniker har beskrivits på annan plats 11, och här beskriver vi ett av de specifika metoder som idag används för att mikroinjicera sjöborre (Strongylocentrotus purpuratus) nyligen befruktade ägg. I över ett sekel har sjöborrar varit en värdefull experimentell modell 15,16. Sjöborrar är evolutionärt nära besläktade med chordates (inklusive oss) och analys avderas genom avslöjade att de innehåller alla de stora genfamiljer som det mänskliga 17. De producerar ett stort antal synkront utveckla transparenta embryon som lätt kan manipuleras. Använda sjöborre som modellorganism har sjöborre samfundet bidragit till vår förståelse av gödsling processen 18-21, cellbiologiska processer 22-24, och genen regleringsnät (GRNs) 25-28.
Mikroinjektion i sjöborre zygotes kräver flera steg. Först äggen behöver immobiliseras före injektioner (beskrivs nedan). Mikroinjektion rätter är belagda med protaminsulfat (PS), som skapar en positivt laddad yta vid vilken de negativt laddade ägg kan vidhäfta 3. Äggen dejellied genom inkubering i surt havsvatten (pH 5,15) under 10 min, följt av två tvättningar i naturligt havsvatten eller artificiellt havsvatten (pH 8,0). De dejellied äggen försiktigt rodde i en rak linjei mitten av PS belagda skålen i närvaro av 1 mM 3-aminotriazol (3-AT), som krävs för att inhibera aktiviteten av ovoperoxidase som utsöndras från kortikala granuler av ägg som ett resultat av befruktning 29. Detta steg är viktigt för att förhindra härdning av gödsling kuvertet och för att underlätta mikroinjektion nål posten. Som ett alternativ till ett mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic syra (PABA) användas. Injektionslösningen laddas i en mikroinjektion nålen med hjälp av specialiserad microloading pipettspetsen och monterade på en hållare fäst till mikromanipulator och tryckenhet (figur 1). Varje nål kan användas för att mikroinjicera enskilda zygoter i flera experiment på separata dagar. Mikroinjektion kan utföras efter 10-15 min tills zygoter hårdna. De zygoter tvättas sedan med havsvatten och odlades vid 15 ° C. När embryona når kläckning blastula skede, de släpper kläckning enzym som smälter komponenter i fertilization kuvertet 30 och tillåta dem att naturligt lossna från PS-belagda skålen. Vid behov kan embryona försiktigt loss från skålen genom att använda en mun pipett eller pasteurpipett genom att försiktigt blåsa havsvatten på embryona. Den beskrivna metoden möjliggör effektiv och tillförlitlig mikroinjektion av 100-400 nyligen befruktade ägg på en enda maträtt, som ger en hög genomströmning metod för analyser i senare led.
Mikroinjektion är en kraftfull teknik för att avge olika behandlingar, såsom DNA, mRNA, rekombinanta proteiner, förlust av funktion och funktionsökning reagens, färgämnen och kombinationer av dessa in i ägg, embryon, och celler av olika organismer 1-7. Dock bör flera faktorer hållas i åtanke när man utformar en mikroinjektion experiment.
Det är oerhört viktigt att beakta lösligheten hos den levererade behandlingen och injektionsvolymen. Om idag injiceras lösningen …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Santiago Suarez för kritisk läsning av manuskriptet och Betty Cowgill stöd i fotografi. Vi tackar även de anonyma granskare för deras kritiska synpunkter. Detta arbete stöds av universitetet i Delaware forskningsfonden.
Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |