אנו מתארים שיטה לביצוע קיבוע יעיל של BMP-2 על גבי משטחים. הגישה שלנו מבוססת על היווצרות monolayer עצמי התאספו כדי להשיג את הקשר הקוולנטי של BMP-2 באמצעות השאריות האמינים שלה בחינם. שיטה זו היא כלי שימושי כדי ללמוד איתות בקרום התא.
morphogenetic עצם חלבון 2 (BMP-2) הוא גורם גדילה משובץ במטריצה תאית של רקמת עצם. BMP-2 משמש כהדק של התמיינות תאי mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה ריפוי והיווצרות עצם נובו דה. השימוש הקליני של אנושי רקומביננטי BMP-2 (rhBMP-2) בשיתוף עם פיגומים העלה מחלוקות האחרונות, המבוסס על המצב של מצגת ואת הסכום כדי להיות מועבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לבדיקות במבחנה בתאים. אנו מתארים כיצד ליצור monolayer עצמית התאספו בהיקף של מקשר heterobifunctional, ולהראות את הצעד מחייב שלאחר מכן כדי להשיג קיבוע קוולנטי של rhBMP-2. עם גישה זו אפשר להשיג מצגת מתמשכת של BMP-2 תוך שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבונים. למעשה, חוסר התנועה של BMP-2 המשטח מאפשרת חקירות ממוקדות על ידי מניעת מודעות נוקבותorption, תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח. שני אירועי האיתות לטווח קצר וארוך מופעלים על ידי BMP-2 מתרחשים כאשר תאים נחשפים למשטחי הצגה משותקים קוולנטית rhBMP-2, מה שהופך את הגישה הזאת מתאימה למחקרים במבחנה בתגובות תא לBMP-2 גירוי.
חלבון morphogenetic עצם 2 (BMP-2) הוא חבר של גורם הפיכת צמיחת משפחה (TGF-β) ופועל כמשדל של דה נובו היווצרות עצם כמו גם רגולטור של כמה רקמות במהלך התפתחות עוברית ובוגר הומאוסטזיס 1-3. כל מונומר של BMP-2 החלבון homodimeric הפעיל הביולוגית מכיל מוטיב "קשר ציסטאין", שזה שמור ביותר בכל 4 BMPs. שש משאריות ציסטאין שבע ליצור קשרי דיסולפיד intramolecular כי לייצב מונומר אחד, ואילו ציסטאין השביעי מעורבים בdimerization, ויצר אג"ח מולקולאריים בין שני מונומרים 5,6. קשר ציסטאין השמור ביותר זה מגדיר את המבנה התל הממדי של חלבון BMP-2 וקובע את המאפיינים הייחודיים שלה, כגון עמידות מפני חום, denaturants וחומצי pH 7-9. BMP-2 נקשר לקולטנים הטרנסממברני קינאז סרין / תראונין, וכך גרימת הולכות אותות <sup> 10-12. בהתאם למצב של oligomerization קולט, מסלולי איתות שונים מופעלים: מפל איתות הסמאד עצמאי מוביל לאינדוקצית phosphatase אלקליין באמצעות איתות p38, ואילו מסלול הסמאד תלוי מופעל על ידי תוצאות זרחון הקולטן בטרנסלוקציה הסמאד המורכבת גרעינית והפעלה של שעתוק של גנים ספציפיים יעד, כגון המעכב של התמיינות (Id) 12-14.
בעצמות, BMP-2 גורם להתמיינות של תאי גזע mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה את הריפוי והיווצרות דה נובו של עצם. נכון לעכשיו, recombinantly הביע BMP-2 מוחל קליני כדי לשפר את הריפוי של אתרים שבורים. אסטרטגיה נפוצה בהנדסת רקמות עצם היא השימוש בגורמי גדילה בזריקות, שהוא פחות פולשני בהשוואה למערכות אספקה מקומיות. עם זאת, במחקרי vivo ויישומים קליניים הראו כי זמן מחצית החיים הביולוגיים קצרים, loc הנוקבalization וסליקה מקומית מהירה של BMP-2 עשויים להוביל למספר בעיות מקומיות, מחוץ לרחם ומערכתית 15. לפיכך, כדי להשיג מצגת יעילה, המלכוד או חוסר תנועה של BMP-2 בתוך או על גבי חומרים הכרחי למסירה באתר היעד מתמשכת והמקומית שלה. משלוח מתמשך ניתן להשיג עם גישות שימור שאינו קוולנטיים, כגון הילכדות פיזית, ספיחה או complexation יון 16. עם זאת, ידוע כי ספיחה לא ספציפית של חלבונים על משטחים עשויות תוצאות בdenaturation של המולקולות 17. לקוולנטיים המחייב של גורמי גדילה, סוגים שונים של תומך פותחו בעשור האחרון. השימוש במולקולות מקשרים bifunctional כי יעד קבוצות אמינו או carboxyl של החלבון לדוגמא, הוא סוג אחד גישה שלא בהכרח דורש שינוי חלבון כדי להשיג קיבועה של. למעשה, בעוד שינוי החלבון מציע את היתרון של השליטה נטייה חלבון,המבוא של תחומים מלאכותיים, תגי פפטיד ורשתות באתר ספציפי עשוי לשנות את הפעילות הביולוגית של גידול גורמי 17. לכן, כדי לעקוף denaturation עקב אינטראקציה עם חומר התמיכה, יכולים להיות פונקציונליות משטחים מראש, למשל, עם monolayer עצמי התאספו (SAM) של מולקולה המקשרת, ואחריו צימוד של הגורם הרצוי 18. יש לנו בשימוש בגישה מבוססת SAM כדי לשתק קוולנטית BMP-2 על גבי משטח על ידי מיקוד השאריות האמינים בחינם והראינו כי החלבון המשותק שומר גם הפעילות הביולוגית לטווח קצר והארוך שלה 19. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לתאים לבדיקות במבחנה על המנגנונים שמתרחשים בקרום התא ומווסתים את האיתות תאית אחראית לאיתות osteogenic.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את הכנת המשטחים פונקציונליות עם rhBMP-2 ביו. גישה זו כוללת שני שלבים: 1) היווצרות הראשונית של monolayer הרכבה עצמית (SAM) של מקשר bifunctional על משטח הזהב, 2) קיבוע קוולנטי של חלבון rhBMP-2. בעבודה קודמת, שתוקפים יעיל מחייב של מקשר bifunctional וגורם הגדילה, והוכחתי כי מש?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לפרופ 'JP פאץ (מחלקה לכימית Biophysical, אוניברסיטת היידלברג ומחלקת לחומרים חדשים וBiosystems, מכון מקס פלאנק למערכות נבונות, שטוטגרט) לתמיכה מהסוג שלו. התמיכה הכספית ממכון מקס פלנק-Gesellschaft וForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG SFB/TR79 לEAC-.) גם הם הכירו באופן משמעותי.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
Acetone | AppliChem | A2282 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
Dichlormethane | Merck | 106050 | |
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
Petroleum benzene | Merck | ||
Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
Methanol | Carl Roth | 4627 | |
N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
PBS | PAA | H15-002 | |
NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Equipment | |||
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |