Kovalent binding af BMP-2 på overflader med en selv-samlet monolag Approach
Summary
Vi beskriver en metode til opstilling af en effektiv immobilisering af BMP-2 på overflader. Vores tilgang er baseret på dannelsen af en selvstændig samlet monolag for at opnå den kovalente binding af BMP-2 via dets frie aminrester. Denne metode er et nyttigt værktøj til at studere signalering på cellemembranen.
Abstract
Knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2) er en vækstfaktor, indlejret i den ekstracellulære matrix af knoglevæv. BMP-2 virker som udløser af mesenkymal celledifferentiering til osteoblaster og dermed stimulere heling og de novo knogledannelse. Den kliniske anvendelse af rekombinant human BMP-2 (rhBMP-2), sammenholdt med stilladser har rejst de seneste kontroverser, baseret på tilstanden af præsentation og det beløb, der skal leveres. Protokollen præsenteres her giver en enkel og effektiv måde at levere BMP-2 for in vitro-undersøgelser på celler. Vi beskriver, hvordan der dannes en selv-samlet monolag bestående af en heterobifunktionel linker, og vise efterfølgende binding trin for at opnå kovalent immobilisering af rhBMP-2. Med denne fremgangsmåde er det muligt at opnå en holdbar præsentation af BMP-2, samtidig med at den biologiske aktivitet af proteinet. Faktisk overfladen immobilisering af BMP-2 giver målrettede undersøgelser ved at forhindre uspecifikke annoncerorption og samtidig reducere mængden af vækstfaktor, og især, at hindre ukontrolleret udslip fra overfladen. Både på kort og lang sigt signaleringsbegivenheder udløst af BMP-2 finder sted, når cellerne udsættes for overflader præsenterer kovalent immobiliseret rhBMP-2, hvilket gør denne metode egnet til in vitro-undersøgelser på celle respons på BMP-2 stimulation.
Introduction
Knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2) er et medlem af den transformerende vækstfaktor (TGF-β)-familien og fungerer som inducer af de novo knogledannelse såvel som regulator af adskillige væv under fosterudviklingen og voksen homeostase 1-3. Hver monomer af det biologisk aktive homodimere BMP-2-protein indeholder et "cysteinknude" motiv, som er stærkt konserveret i alle BMP'er 4. Seks af de syv cysteinrester danner intramolekylære disulfidbindinger, som stabiliserer hver monomer, mens den syvende cystein er involveret i dimerisation, danner en intermolekylær binding mellem de to monomerer 5,6. Dette stærkt konserverede cysteinknude definerer den tredimensionale struktur af BMP-2-protein og bestemmer dets unikke egenskaber, såsom modstandsdygtighed over for varme, denatureringsmidler og sur pH 7-9. BMP-2 binder til serin / threonin kinase transmembrane receptorer, for derved at inducere signaltransduktion <sup> 10-12. Afhængig af formen af receptoroligomerisering der forskellige signalveje aktiveret: a Smad-uafhængig signaleringskaskade fører til alkalisk fosfatase induktion via p38 signalering, mens en Smad-afhængige vej aktiveres af receptorfosforylering resultater i Smad komplekse nukleare translokation og aktivering af transskription af specifikke målgener, såsom inhibitor af differentiering (Id) 12-14.
I knogler, BMP-2 inducerer differentiering af mesenkymale stamceller til osteoblaster og dermed stimulere den helbredende og de novo dannelsen af knogle. I øjeblikket rekombinant udtrykt BMP-2 anvendes klinisk til at øge helingen af brækkede sites. En almindelig strategi i knoglevæv teknik er brugen af injicerbare vækstfaktorer, hvilket er mindre invasiv sammenlignet med lokale afgivelsessystemer. Imidlertid har in vivo-undersøgelser og kliniske anvendelser vist, at den korte biologiske halveringstid, uspecifik localt andet lige og hurtig lokal clearance af BMP-2, kan føre til flere lokale, ektopiske og systemiske problemer 15. Derfor, for at opnå en effektiv præsentation, klemning eller immobilisering af BMP-2 inden for eller på materialer er nødvendigt for dens lokale og vedvarende levering på target site. Vedvarende levering kan opnås med ikke-kovalente tilbageholdelse tilgange, såsom fysisk entrapment, adsorption eller ion kompleksdannelse 16. Imidlertid er det kendt, at uspecifik adsorption af proteiner til overflader kan resulterer i denaturering af molekylerne 17. Til den covalente binding af vækstfaktorer har forskellige typer af understøtninger blevet udviklet i løbet af det sidste årti. Brugen af bifunktionelle forbinder molekyler, der er målrettet amino-eller carboxylgrupper af proteinet for eksempel, er en type af tilgang, der ikke nødvendigvis kræver protein modifikation at nå sit immobilisering. I virkeligheden, mens protein modifikation har den fordel, at kontrollere protein orientering,indførelsen af kunstige domæner, peptid tags og stedspecifikke kæder kan ændre den biologiske aktivitet af vækstfaktorer 17. Således at omgå denaturering på grund af interaktion med det understøttende materiale overflader kan funktionaliseres på forhånd, for eksempel med en selv-samlet monolag (SAM) af et linkermolekyle, efterfulgt af kobling af den ønskede faktor 18. Vi har brugt en SAM tilgang til kovalent immobilisere BMP-2 på en overflade ved at målrette sine frie aminrester og har vist, at det immobiliserede protein bevarer både den korte og langsigtede biologiske aktivitet 19. Denne protokol giver en enkel og effektiv måde at levere BMP-2 til celler til in vitro-undersøgelser på de mekanismer, der opstår ved cellemembranen og regulerer intracellulær signalering ansvarlig for osteogenisk signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol beskriver vi forberedelse af overflader funktionaliserede med bioaktive rhBMP-2. Denne fremgangsmåde består af to trin: 1) den indledende dannelsen af en selvsamlende monolag (SAM) i en bifunktionel linker på guld overflade, 2) kovalent immobilisering af rhBMP-2 protein. I tidligere arbejde har vi valideret effektiv binding af den bifunktionelle linker og vækstfaktoren, og viste, at overflade-immobiliserede rhBMP-2 bevarer sin biologiske aktivitet 19. Bioaktiviteten af vækstfaktore…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Prof. JP Spatz (Institut for Biofysisk kemi, University of Heidelberg og Institut for nye materialer og Biosystems, Max Planck Instituttet for Intelligent Systems, Stuttgart) for hans venlige støtte. Den finansielle støtte fra Max-Planck-Gesellschaft og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 til ØK-A.), Er også i høj grad anerkendt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |
Riferimenti
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D’Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors – the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
