Isolering, kultur, och transplantation av muskelsatellitceller
Summary
Den isolering och odling av en ren population av vilande satellitceller, en muskel stamceller befolkningen, är avgörande för förståelsen av muskelstamcellsbiologi och förnyelse, samt stamcellstransplantation för terapier i muskeldystrofi och andra degenerativa sjukdomar.
Abstract
Muskelsatellitceller är en stamcellspopulation krävs för postnatal skelettmuskelutveckling och förnyelse, som står för 2-5% av sublaminal kärnor i muskelfibrerna. I vuxen muskel, satellit celler normalt mitotiskt vilande. Efter skador, dock satellitceller initiera cellulär proliferation att producera myoblasts, deras avkommor, att medla förnyelse av muskeln. Transplantation av satellit-cellerna myoblasts har studerats som en möjlig terapi för flera regenerativa sjukdomar inklusive muskeldystrofi, hjärtsvikt, och urologisk dysfunktion. Myoblast transplantation in dystrofisk skelettmuskel, infarkt hjärta, och funktionsstörningar urinkanaler har visat att engrafted myoblaster kan differentiera till muskelfibrer i värdvävnader och uppvisar partiell funktionell förbättring i dessa sjukdomar. Därför är utvecklingen av effektiva metoder för vilande satellit celler från skelett muscl reningse, liksom inrättandet av satellit-cellerna myoblast kulturer och transplantationsmetoder för myoblasts, är avgörande för att förstå de molekylära mekanismerna bakom satellitcellsjälvförnyelse, aktivering och differentiering. Dessutom har utvecklingen av cellbaserade terapier för muskeldystrofi och andra regenerativa sjukdomar är också beroende av dessa faktorer.
De nuvarande potentiella reningsmetoder quiescent satellit celler kräver användning av dyra fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-maskiner. Här presenterar vi en ny metod för snabb, ekonomisk och pålitlig rening av vilande satellitceller från vuxen mus skelettmuskel genom enzymatisk dissociation följt av magnetaktiverad cellsortering (MACS). Efter isolering av rena vilande satellitceller, kan dessa celler odlas för att få ett stort antal myoblasts efter flera passager. Dessa nyisoleradevilande satellitceller eller ex vivo expanderade myoblasts kan transplanteras in i cardiotoxin (CTX)-inducerad regenere musen skelettmuskulatur för att undersöka bidraget av givar-härledda celler att regenerera muskelfibrer, samt satellitcellfack för granskning av självförnyelse aktiviteter.
Introduction
Muskelsatellitceller är en liten population av myogenic stamceller vid nedre kanten av basala lamina av skelettmuskelfibrerna. De kännetecknas av uttrycket av PAX7, PAX3, c-Met, M-cadherin, CD34, Syndecan-3, och kalcitonin 1 – 3. Satellitceller har visat sig vara ansvarig för muskelregeneration som muskelstamceller. I vuxen muskel, satellit celler normalt mitotiskt vilande 4-8. Efter skada, är satellitceller aktiveras, initiera uttryck för MyoD, och in i cellcykeln för att utöka sin avkomma, kallas myogena precursorceller eller myoblasts 3. Efter flera omgångar av celldelning, myoblaster ur cellcykeln och säkring till varandra i syfte att undergå differentiering till multikärnförsedda myotuber, följt av mogen muskelfibrer. Myoblaster isolerade från vuxen muskler kan lätt expanderade ex vivo. Kapaciteten för myoblasts att bli muskelfibrer i regenererande muskler ochbildar ektopisk muskelfibrer i nonmuscle vävnader utnyttjas av myoblast transplantation, en potentiell terapeutisk metod för Duchennes muskeldystrofi (DMD) 4, urologisk dysfunktion 9, och hjärtsvikt 10. I själva verket har myoblasts framgångsrikt transplanterats i muskeln både MDX (DMD modell) möss och DMD-patienter 11-14. De injicerade normala myoblaster smälta samman med värd muskelfibrer att förbättra histologi och funktion av den sjuka muskler. Tidigare arbete visade att subpopulationer av myoblasts är mer stamcellslika och förbli i ett odifferentierat tillstånd längre i muskeln under muskelregeneration 5. Senaste arbete har visat att nyligen isolerade satellitceller från vuxna muskler innehåller en stamcellsliknande population som uppvisar effektivare engraftment och självförnyelse aktivitet i regenererande muskler 5-8. Därför rening av en ren population av vilande satellitceller från vuxna skelett muscle är väsentliga för förståelsen av biologin av satellitceller, myoblaster och muskelregenerering, och för utvecklingen av cellbaserade terapier.
De nuvarande potentiella reningsmetoder quiescent satellit celler kräver användning av en dyr fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-maskin 1,2,6-8. Dessutom tenderar FACS laserexponering för att inducera celldöd under separation, vilket orsakar lägre utbyte av vilande satellitceller 15. Här presenterar vi en ny metod för snabb, ekonomisk och pålitlig rening av vilande satellitceller från vuxen mus skelettmuskel. Denna metod utnyttjar enzymatisk dissociation följt av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS). Efter isolering av rena vilande satellitceller, kan dessa celler odlas för att få ett stort antal myoblasts efter flera passager. Vi visar också att intramuskulär injektion av dessa nyligen isolerade vilande satellitceller eller ex VIvo utökade myoblasts kan transplanteras in i cardiotoxin (CTX)-inducerad regenere musen skelettmuskulatur för att undersöka bidraget av givar-härledda celler att regenerera muskelfibrer, samt till satellitcell fack för granskning av självförnyelseverksamhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll kan vilande satellitceller lätt renas från vuxen skelettmuskel av möss genom kollagenasdigerering och yta antikroppsmedierad MACS separation. Denna metod tar cirka 6 timmar och behöver inte någon dyr utrustning såsom en FACS maskin. Dessutom är denna metod relativt billigt jämfört med ytan antikroppsmedierad FACS-separation. En högre avkastning på vilande satellitceller väntas också i jämförelse med FACS för denna metod eftersom FACS laserexponering tenderar att framkalla celldöd vid s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Shahragim Tajbakhsh för åstad Myf5 + / nLacZ möss. Vi tackar också Alexander Hron och Michael Baumrucker för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete har finansierats med bidrag från muskeldystrofi Association (MDA) och Gregory Marzolf Jr MD Center Award.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
Riferimenti
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
