Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon
Summary
Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.
Abstract
Kas uydu hücreleri kas lifleri sublaminal çekirdekleri% 2-5 için muhasebe, doğum sonrası iskelet kas gelişimi ve yenilenmesi için gerekli bir kök hücre nüfus vardır. Yetişkin kas olarak, uydu hücreleri, normal olarak sakin mitotikal olarak bulunmaktadır. Yaralanma sonrasında, ancak, kas uydu hücreleri, rejenerasyonunu aracılık etmek miyoblastları kendi yavrularıyla üretmek için hücre çoğalmasını başlatabilir. Uydu hücresinden türetilmiş miyoblastların nakli yaygın müsküler distrofi, kalp yetmezliği, ve ürolojik işlev bozukluğu dahil olmak üzere birçok reaktif hastalıklar için olası bir tedavisi olarak incelenmiştir. Distrofik iskelet kası, enfarkte kalp ve disfonksiyonu idrar kanallarına Miyoblast nakli engrafted miyoblastlardır, ev sahibi dokulardaki kas lifleri farklılaşmak ve bu hastalıklarda kısmen fonksiyonel iyileşme görüntüleyebilir göstermiştir. Bu nedenle, iskelet muscl ikinci hareketsiz uydu hücrelerin verimli saflaştırma yöntemlerinin geliştirilmesie yanı sıra uydu hücre kaynaklı myoblast kültürler ve miyoblastların için nakli yöntemlerinin kurulması gibi, uydu hücre kendini yenileme, aktivasyonu ve farklılaşması arkasında moleküler mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Buna ek olarak, kas distrofisi ve diğer hastalıklar için rejeneratif hücre bazlı terapiler geliştirilmesi, aynı zamanda, bu faktörlere bağlıdır.
Ancak, sakin uydu hücrelerin prospektif saflaştırma yöntemleri pahalı floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) makinalarının kullanımını gerektirir. Burada, (MACS) manyetik ayırma ile aktive edilmiş hücre ardından enzimsel aynşma ile yetişkin fare iskelet kasından hareketsiz uydu hücreleri, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir saflaştırma için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Saf hareketsiz uydu hücrelerin izolasyonundan sonra, bu hücreler, birkaç geçiş sonrasında miyoblastların sayıda elde edilmesi için kültürlenebilir. Bu taze izole edilmişsakin uydu hücreleri veya ex vivo genişletilmiş miyoblastlardır kalbi etkileyen naklediliyor olabilir (CTX) kas lifleri rejenere için donör kaynaklı hücrelerin katkısını incelemek için fare iskelet kas yenileyici kaynaklı, hem de kendini yenileme incelenmesi için uydu hücre bölmelerine faaliyetleri.
Introduction
Kas uydu hücreleri iskelet kas liflerinin bazal lamina altında bulunan miyojen kök hücrelerin küçük bir nüfus vardır. Bunlar Pax7, Pax3, c-Met, M-kaderin, CD34, sindekan-3 ekspresyonu ile karakterize edilir ve kalsitonin 1 – 3. Uydu kas hücreleri, kök hücreleri gibi kas rejenerasyon sorumlu olduğu kanıtlanmıştır. Erişkin kas, uydu hücreler normalde 4-8 mitotikal durgundur. Yaralanma sonrasında, uydu hücreleri MyoD ekspresyonunu başlatmak ve bunların döl genişletmek için hücre döngüsüne girmelerini, aktive edilir, miyojenik öncü hücreleri veya miyoblastları 3 olarak adlandırılır. Hücre bölünmesinin birkaç tur sonra miyoblastlardır olgun kas lifleri ve ardından çok çekirdekli miyotüplerinin içine farklılaşmasını geçmesi amacıyla birbirine hücre döngüsü ve sigorta çıkar. Erişkin kas izole miyoblastlardır kolayca ex vivo genişletilebilir. Kas yenileyici ve kas lifleri olmak miyoblastların için kapasitenonmuscle dokularda form ektopik kas lifleri myoblast nakli, Duchenne müsküler distrofi (DMD) 4 için potansiyel bir tedavi yaklaşımı, ürolojik disfonksiyon 9, ve kalp yetmezliği 10 tarafından istismar edilmektedir. Nitekim, miyoblastlardır başarıyla hem mdx (DMD modeli) fareler ve DMD hastalarında 11-14 kas nakil edilmiştir. Enjekte Normal miyoblastlardır hastalıklı kas histoloji ve işlevini geliştirmek için konak kas lifleri ile sigorta. Önceki iş miyoblastların subpopülasyonunun fazla hücre-benzeri kök ve kas rejenerasyon 5 sırasında kas uzun bir farklılaşmamış durumda kalır olduğunu göstermiştir. Son çalışmalar, yetişkin kas uydu hücreleri, taze izole edilmiş kas 5-8 rejenere daha verimli uyumunu ve kendini yenileme aktivite sergileyen bir kök hücre benzeri popülasyonu içeren göstermiştir. Bu nedenle, yetişkin iskelet mu ikinci hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfus saflaştırılmasıSCLE uydu hücreleri, kas iskelet hücreleri ve yenilenme biyolojisi anlamak için ve hücre bazlı terapiler geliştirilmesi için önemlidir.
Ancak, sakin uydu hücrelerin prospektif saflaştırma yöntemleri pahalı bir floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) makine 1,2,6-8 kullanılmasını gerektirir. Buna ek olarak, lazer FACS maruz hareketsiz uydu hücrelerin 15 daha düşük verim neden ayrılması sırasında, hücre ölümüne neden olma eğilimindedir. Burada, yetişkin fare iskelet kasından hareketsiz uydu hücreleri, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir saflaştırma için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, (MACS) manyetik ayırma ile aktive edilmiş hücre ardından enzimatik ayrışma kullanır. Saf hareketsiz uydu hücrelerin izolasyonundan sonra, bu hücreler, birkaç geçiş sonrasında miyoblastların sayıda elde edilmesi için kültürlenebilir. Ayrıca göstermektedir ki bu yeni izole edilmiş hareketsiz uydu hücrelerin ya da eski vi intramüsküler enjeksiyonuvo genişletilmiş miyoblastlardır kalbi etkileyen naklediliyor olabilir (CTX) kas lifleri yanı sıra, kendini yenileme faaliyetlerinin incelenmesi için uydu hücre bölmelerine yenileyici için donör kaynaklı hücrelerin katkısını incelemek için fare iskelet kas yenileyici kaynaklı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, hareketsiz uydu hücreleri kolayca kollajenaz sindirimi ve yüzey antikor aracılı MACS ayırma ile farelerin yetişkin iskelet kasından saflaştırılabilir. Bu yöntem, yaklaşık olarak 6 saat sürer ve bir makine gibi bir FACS pahalı ekipman gerek yoktur. Buna ek olarak, bu yöntem, yüzey antikor aracılı FACS ayrımına göre daha ucuzdur. FACS lazer maruz ayrılması sırasında 15 hücre ölümüne neden olmaya eğilimli olduğu için pasif uydu hücrelerin daha yüksek bir verim, ayn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Myf5 + / nLacZ fareler sağlamak için Dr Shahragim Tajbakhsh teşekkür ederim. Biz de bu yazının eleştirel okuma için Alexander HRON ve Michael Baumrucker teşekkür ederim. Bu çalışma Müsküler Distrofi Derneği (MDA) ve Gregory Marzolf Jr MD Merkezi Ödülü hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
Riferimenti
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
