Vi beskriver bruken av monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 for kombinert påvisning av celleoverflateantigener via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for identifisering og berikelse av levende humane embryonale stamceller (hESC) ved hjelp av positiv seleksjon og også bruk av negativt utvalg for å rense hESCer fra en blandet cellepopulasjon.
Humane embryonale stamceller (hESC) kan selvfornye på ubestemt tid in vitro, og med de riktige signalene kan induseres for å skille seg ut i potensielt alle somatiske celleavstamninger. Differensierte hESC-derivater kan potensielt brukes i transplantasjonsterapier for å behandle en rekke celledegenerasjonssykdommer. HESC-differensieringsprotokoller gir imidlertid vanligvis en blanding av differensierte mål- og off-target celletyper, samt gjenværende uavklarte celler. For oversettelse av differensierte hESC-derivater fra laboratoriet til klinikken er det viktig å kunne diskriminere mellom uavklarte (pluripotente) og differensierte celler, og generere metoder for å skille disse populasjonene. Sikker påføring av hESC-avledede somatiske celletyper kan bare oppnås med pluripotente stamcellefrie populasjoner, da gjenværende hESCer kan indusere svulster kjent som teratomer etter transplantasjon. Mot dette formål beskriver vi her en metodikk for å oppdage pluripotens assosierte celleoverflateantigener med monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for identifisering av pluripotente TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs ved hjelp av positiv seleksjon. Ved å bruke negativt utvalg med vår TG30/GCTM-2 FACS-metodikk, kunne vi oppdage og rense udifferensierte HESCer i populasjoner som gjennomgår svært tidlig differensiering (TG30Neg-GCTM-2Neg). I en videre studie dannet ikke pluripotente stamcellefrie prøver av differensiert TG30Neg-GCTM-2Neg-celler valgt ved hjelp av vår TG30/GCTM-2 FACS-protokoll teratomer en gang transplantert til immunkompenserte mus, og støttet robustheten i protokollen vår. På den annen side påvirket TG30/GCTM-2 FACS-mediert påfølgende passivitet av beriket pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs ikke deres evne til selvfornyelse i vitro eller deres iboende pluripotens. Derfor gir egenskapene til vår TG30 / GCTM-2 FACS-metodikk en sensitiv analyse for å oppnå svært berikede populasjoner av hPSC som innganger for differensieringsanalyser og for å kvitte seg med potensielt tumorigogene (eller gjenværende) hESC fra derivatcellepopulasjoner.
HPSC (hPSC) inkluderer humane embryonale stamceller (hESC) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hIPSC). HPSC kan fornye seg selv på ubestemt tid under passende kulturforhold uten å miste evnen kjent som “pluripotency”. Pluripotens er definert som potensialet for en celle å skille seg ut i i hovedsak enhver somatisk cellelinje, inkludert celler som er representative for hvert av de tre embryonale bakteriecellelagene. Det bemerkelsesverdige potensialet til hPSC gir et middel for et stort utvalg av cellebaserte applikasjoner, inkludert terapeutiske alternativer. For eksempel er det lidelser som involverer celledød og degenerasjon, hvor normal funksjonalitet av celler i menneskekroppen er kompromittert, som i hjertesvikt, ryggskader, diabetes, Parkinsons sykdom, noen kreftformer og andre kliniske patologier. Pasienter som lider av disse tilstandene kan potensielt bli behandlet ved å transplantere sunne og funksjonelle somatiske celler som er avledet fra hPSC i laboratoriet. Imidlertid er de nåværende hPSC-differensieringsprotokollene ikke 100% effektive og gir en blanding av differensierte mål- og off-target celletyper, samt gjenværende hPSCer som ikke har gjennomgått differensiering, i stedet fortsetter å fornye1-3. Tilstedeværelsen av selv et lite antall hPSC i et utvalg av hPSC-avledede somatiske celler beregnet for transplantasjon til pasienter utgjør en alvorlig klinisk risiko som disse cellene av deres iboende natur for å danne vev av alle tre embryonale bakterielag, kan potensielt danne in vivo en type svulst kjent som en teratoma. Derfor kan bare målcellepopulasjoner som er fast bestemt på å være fri for pluripotente stamceller, betraktes som trygge for transplantasjon til pasienter. Det er flere tilnærminger rapportert for å potensielt utføre rensing av gjenværende hPSCer etter differensiering, (for gjennomgang se Polanco og Laslett4). Vi har tidligere rapportert bruken av monoklonale antistoffer TG30 (CD9) og GCTM-2 koblet til fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å identifisere pluripotente stamceller og diskriminere dem fra celler som gjennomgår tidlig stadium av differensiering i kulturer avhESC-linjer 5-7.
En fordel med å bruke antistoffer for å oppdage celleoverflateantigener er at målcellene vanligvis er levedyktige etter antistoffbinding og/eller merking. Derfor kan målceller samles etter antistoffmerking og recultured for ekspansjon og videre applikasjoner før transplantasjon. En advarsel for celleoverflateantigener uttrykt på hPSC er at de ikke er eksklusive for pluripotentstadiet og i mange tilfeller uttrykkes timelig under utvikling og vil derfor bli oppdaget i noen differensierte celletyper. Derfor, hvis målet er å bruke antistoffer for å oppdage menneskelige pluripotente celler og rense dem fra en prøve av hPSC-avledede celler, bør utvalgte antistoffer ikke også reagere med antigener på de spesifikke differensierte celletypene beregnet for transplantasjon. Dessverre er det begrenset antall antistoffer som oppdager celleoverflatemarkører på live hPSCs 4, noe som gjør begrensede alternativer for valg. I tillegg har noen få studier påpekt at påvisning av en enkelt celleoverflatemarkør ikke er tilstrekkelig til å eliminere alle hPSC, noe som tyder på at ethvert forsøk på å eliminere alle hPSC pluripotente subpopulations bør stole på metoder som bruker to eller flere antistoffer som oppdager forskjellige epitoper uttrykt av hPSCs 9-10. Som nevnt ovenfor er bare hPSC-avledede celler som kan bestemmes som pluripotente stamcellefrie cellepopulasjoner egnet for menneskelig transplantasjon. Å nå dette nivået av strenghet kan ikke oppnås med en enkelt pass gjennom en antistoffmediert celle sorteringsteknologi. Rekultur av den berikede populasjonen av differensierte målceller og påfølgende runder med cellesortering kan være nødvendig for å definitivt få pluripotente stamcellefrie prøver.
I vårt laboratorium har vi i stor grad karakterisert to hES celleoverflate antistoffer, TG30 (CD9) og GCTM-2, for påvisning av levende pluripotente celler. Våre studier har vist at kombinert deteksjon av både TG30 og GCTM-2 sterkt korrelerer med uttrykket av kanoniske pluripotensrelaterte gener i hESC-linjer 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofilering har konsekvent vist at hESC-kulturer utgjør en kvantitativ kontinuerlig gradient av TG30/GCTM-2 uttrykk 5-7. Vi har vilkårlig etablert fire populasjoner (P) av celler i denne TG30 / GCTM-2 gradient: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) og P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Vår karakterisering av disse P4-, P5-, P6- og P7-cellepopulasjonene har vist at P6- og P7-subfraksjonene uttrykker et stort antall pluripotensrelaterte gener og effektivt danner stammelignende kolonier når de rekultureres etter FACS 2-3. På den annen side uttrykker P4-celler (TG30Neg-GCTM-2Neg) et stort antall differensieringsmarkører og utgjør de spontant differensierte celletypene som vanligvis forekommer i ekspanderende kulturer av hESC-linjer 5-6. Vi bestemte oss for å teste potensialet i vår TG30 / GCTM-2 FACS for selektiv eliminering av gjenværende hPSCer etter tidlig stadiumdifferensiering, og også for berikelse av pluripotente stamcellepopulasjoner. Protokollen beskrevet nedenfor viser hvordan du samler inn og rekulturerer differensiert P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg) celler etter FACS for å oppnå rensing av pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Videre forklarer vi også innsamling og rekultur av pluripotente P7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi) celler for å oppnå en beriket kultur av pluripotente celler, som senere kan brukes som en definert inngangspopulasjon for potensielt å øke effektiviteten og konsistensen av differensieringsanalyser.
I klinisk sammenheng er differensierte somatiske celletyper det endelige ønskede produktet for transplantasjon og terapeutiske anvendelser, og hPSC er en selvfornyende og skalerbar kilde for å generere de somatiske cellene eller deres forfedre i laboratoriet. Tilstedeværelsen av gjenværende undifferentiated hESCs med et iboende potensial for teratomadannelse er en sikkerhetsrisiko når man vurderer hESC-avledede somatiske celler for transplantasjon til pasienter. For en gjennomgang av dette og andre risikoer forbundet med celleterapi, vennligst se Sharpe et al. 16 Derfor, for å realisere slike applikasjoner, er det viktig at forskere tar sikte på å generere målcellepopulasjoner som også er pluripotente stamcellefrie. Mot dette formål demonstrerer vi her at ved hjelp av vår TG30 / GCTM-2 FACS-metodikk er det mulig å overvåke for tilstedeværelsen av pluripotente celler (TG30Hi-GCTM-2Hi) i en differensierende cellepopulasjon og oppnå levedyktige hESC-differensierte derivater som kan berikes og rekultureres etter FACS. Selv om det ikke er mulig å få 100% pluripotente stamcellefrie prøver med en enkelt pass av vår protokoll, kan berikede hESC-derivater recultured og etter påfølgende passaging oppnås 100% somatisk celle renhet. Den demonstrerte levedyktigheten til somatiske celler for ekspansjon etter FACS muliggjør også potensielt produksjon av tilstrekkelig antall celler egnet for potensielle transplantasjonsterapier.
De oppmuntrende resultatene av denne pilotstudien fikk oss til å utføre en mer omfattende undersøkelse ved hjelp av vår TG30 / GCTM-2-protokoll i en komparativ studie med flere menneskeskapte pluripotente stamcellelinjer (hiPSC)15. I den studien fant vi ut at pluripotente stamcellefrie prøver oppnådd ved hjelp av vår TG30/GCTM-2 FACS-protokoll ikke genererte teratomer når de transplanteres til immunberømte mus. Derfor kan vi trygt si at med bruk av denne in vitro-protokollen utvikler tidlig stadium differensieringscellekulturer som er fast bestemt på å være fri for pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi-celler ikke utvikler teratomer in vivo. Dette støtter sterkt robustheten til analysen vår, og gir en potensiell tilnærming for å eliminere risikoen for teratomadannelse før bruk av hPSC-avledede celler i kliniske applikasjoner.
Omvendt viser vi også at TG30 / GCTM-2 FACS-analysen kan brukes til å hente en pluripotent cellepopulasjon med høyt uttrykksnivå av disse to overflateantigenene (TG30Hi-GCTM-2Hi). Tidligere studier har vist atTG30 Hi-GCTM-2Hi-celler har den høyeste korrelasjonen med OCT4hi expression og danner det høyeste antallet hESC-lignende kolonier5,6,13,15. Vi er derfor grunnen til at pluripotensnettverket aktiveres på sitt maksimale nivå i TG30Hi-GCTM-2Hi som uttrykker celler. Vi anser at bruk av våre TG30/GCTM-2 FACS-protokoll og henting av P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)kan muliggjøre storskala rensing av berikede levende hESC-kulturer, som innganger til differensieringsanalyser.
Til slutt demonstrerer vi her potensialet i våre FACS-analyser basert på det kombinerte uttrykket av overflateantigener TG30 og GCTM-2 for både rensing og berikelse av hESCs. Fremtidige studier med protokoller for rettet differensiering av hPSCer vil sannsynligvis også være informative med hensyn til dette potensialet. Vi er klar over at i noen analyser der differensierte hESC-derivater midlertidig uttrykker TG30 (CD9) eller GCTM-2, kan disse to antistoffene ikke være passende eller tilstrekkelige til å rense pluripotente celler fra en differensiert populasjon på et bestemt tidspunkt i analysen6. Derfor er det et løpende behov for å finne nye antistoffer som spesifikt gjenkjenner levende hESCer for å overvinne den mulige begrensningen av kryssreaksjon med noen differensierte celletyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker StemCore-anlegget ved Monash University for levering av hESC-linjer og FlowCore-anlegget ved Monash University for FACS-tjenester. Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend fra Australian Stem Cell Centre, New South Wales og Victorian Government Stem Cell Research Grant Program til ALL. ALL er partneretterforsker av Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative i Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
Table 4. List of materials and reagent | |||
[header] | |||
FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Table 5. List of equipment. |