के व्यवस्थित विश्लेषण<em> इन विट्रो</emएक मल्टी अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली का उपयोग करना> सेल रोलिंग
Summary
यह अध्ययन काफी physiologically प्रासंगिक कतरनी प्रवाह के तहत सेल रोलिंग पढ़ाई के throughput बढ़ाने, एक बहु – अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली का इस्तेमाल किया. झरना और रोगियों में कोशिकाओं की एक्सोजेनस आबादी की प्रणालीगत प्रसव के बाद सेल घर वापस आना के महत्व को घर वापस आना बहु कदम सेल में सेल रोलिंग के महत्व को देखते हुए इस प्रणाली सेल आधारित चिकित्सा में सुधार के लिए एक स्क्रीनिंग मंच के रूप में क्षमता प्रदान करता है.
Abstract
सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक बड़ी चुनौती प्रणालीबद्ध नसों या intraarterial अर्क निम्न ब्याज के ऊतकों को उच्च क्षमता के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा को लक्षित करने की अक्षमता है. नतीजतन, सेल घर वापस आना बढ़ती वर्तमान में सेल थेरेपी में सुधार करने के लिए एक रणनीति के रूप में अध्ययन किया है. संवहनी endothelium पर रोलिंग सेल सेल घर वापस आना की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है और एक समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर (PPFC) का उपयोग इन विट्रो जांच की जा सकती. बहरहाल, यह खराब नियंत्रित प्रवाह की स्थिति के साथ एक बहुत ही कठिन है, कम throughput परख है. इसके बजाय, हम ठीक नियंत्रित, physiologically प्रासंगिक कतरनी प्रवाह 1,2 के तहत एक उच्च throughput में सेलुलर रोलिंग गुणों के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है कि एक बहु – अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली का इस्तेमाल किया. इस पत्र में, हम पी और ई selectin में लिपटे सतहों पर और साथ ही सेल monolayer में लिपटे सतहों पर एच. एल -60 (मानव प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया) कोशिकाओं के रोलिंग गुण readil कैसे हो सकता है दिखानेY जांच की. बेहतर भड़काऊ शर्तों अनुकरण, microfluidic चैनल सतह तो काफी गतिशील परिस्थितियों में एच. एल -60 कोशिकाओं के साथ बातचीत में वृद्धि, ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α) के साथ सक्रिय थे जो endothelial कोशिकाओं (ईसीएस), के साथ लेपित किया गया था. बढ़ाया throughput और ऐसे वेग रोलिंग और पथ रोलिंग के रूप में मानकों का तेजी से विश्लेषण परमिट कि एकीकृत मल्टी पैरामीटर सॉफ्टवेयर विश्लेषण मंच, इन विट्रो सेल रोलिंग गुणों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं. सेल रोलिंग और घर वापस आना प्रभावित करने के लिए बनाया गया इंजीनियरिंग दृष्टिकोण का तेजी से और सटीक विश्लेषण की अनुमति, इस मंच अग्रिम एक्सोजेनस सेल आधारित चिकित्सा मदद मिल सकती है.
Introduction
सेल आधारित चिकित्सा के सफल नैदानिक अनुवाद में प्रमुख चुनौतियों में से एक अकुशल वितरण या वांछित साइटों 3,4 को प्रणालीबद्ध संचार कोशिकाओं का लक्ष्य है. नतीजतन, सेल घर वापस आना सुधार करने के तरीकों के लिए एक निरंतर खोज है, और विशेष रूप से सेल थेरेपी में सुधार करने के लिए एक रणनीति के रूप में, रोलिंग सेल. रक्त वाहिकाओं पर रोलिंग सेल प्रतिष्ठित रोग साइटों 5 के लिए भर्ती कर रहे हैं कि leukocytes के लिए परिभाषित सेल घर वापस आना झरना, में एक महत्वपूर्ण कदम है. यह कदम endothelial selectins के बीच विशेष बातचीत के द्वारा नियंत्रित होता है, यानी पी और ई selectin (पी और ई एसईएल), और leukocytes 5,6 की सतह पर उनके काउंटर ligands. बेहतर समझ और सेल घर वापस आना की कार्यकुशलता में सुधार, और विशेष रूप से रोलिंग कदम, सेल आधारित चिकित्सा में सुधार के लिए नए प्लेटफॉर्म के लिए खोज में बहुत महत्व के हैं. तिथि करने के लिए इस दो फ्लैट बेनी शामिल समानांतर थाली प्रवाह कक्षों (PPFCs) का उपयोग करके हासिल किया गया हैएक सेल निलंबन एक सिरिंज 7,8, 9 पंप का उपयोग करके perfused है जिसके माध्यम से ऊपरी प्लेट पर स्थित एक प्रवाह और बहिर्वाह बंदरगाह, साथ उन दोनों के बीच एक गैसकेट, साथ तों. नीचे की थाली की सतह एक प्रासंगिक सेल monolayer / substrates के साथ लेपित किया जा सकता है और कतरनी प्रवाह के तहत perfused कोशिकाओं और सतह के बीच बातचीत फिर 7 का पता लगाया है. हालांकि, PPFC बुलबुला गठन, रिसाव, और प्रमुख कमियां पेश खराब नियंत्रित प्रवाह के साथ एक कम throughput, अभिकर्मक लेने, और काफी थकाऊ विधि है.
पारंपरिक PPFC के लिए एक वैकल्पिक तकनीक कम अभिकर्मक खपत 1,10 के साथ, सही, कंप्यूटर नियंत्रित कतरनी प्रवाह के तहत सेलुलर assays के उच्च throughput प्रदर्शन (PPFCs से करने के लिए 10 गुना अधिक) की अनुमति, एक बहु – अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली है. सेल रोलिंग प्रयोगों USI सेल monolayers या इंजीनियर substrates के साथ लेपित और imaged किया जा सकता है, जो microfluidic चैनलों के अंदर प्रदर्शन कर रहे हैंएनजी रोलिंग गुणों के साथ एक माइक्रोस्कोप, आसानी से एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग का विश्लेषण किया. इस अध्ययन में, हम मानव प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया विभिन्न सतहों पर (एच. एल -60) कोशिकाओं के रोलिंग गुणों का अध्ययन करके इस बहु – अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली की क्षमताओं का प्रदर्शन. एच. एल -60 पी और ई एसईएल, साथ ही विभिन्न रोलिंग रिसेप्टर्स व्यक्त सेल monolayers पर, विश्लेषण किया गया था तरह substrates पर रोलिंग. इसके अलावा, एंटीबॉडी (अब) उन सतहों पर एच. एल -60 के रोलिंग आंदोलन मध्यस्थता में विशिष्ट selectins की प्रत्यक्ष भागीदारी प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अवरुद्ध. रोलिंग प्रयोगों ऐसे रोलिंग वेग, रोलिंग कोशिकाओं की संख्या, और रोलिंग पथ गुण के रूप में महत्वपूर्ण रोलिंग मापदंडों के कुशल विश्लेषण की अनुमति, कम से कम अभिकर्मक / सेल की खपत के साथ, स्थिर कतरनी प्रवाह के तहत, बढ़ा throughput के साथ प्रदर्शन किया गया.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक्सोजेनस सेल आधारित चिकित्सा के सफल अनुवाद में प्रमुख चुनौतियों में से एक कुशलता से उच्च engraftment दक्षता 3 के साथ चोट और सूजन की साइटों के लिए कोशिकाओं को वितरित करने के लिए अक्षमता है. सेल रोलिंग अंतत?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चो पी कोशिकाओं डॉ. बारबरा Furie (Beth इसराइल Deaconess मेडिकल सेंटर, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) से एक तरह का उपहार थे. इस काम JMK तक यह काम भी JMK को एक Movember-प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन चैलेंज पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था स्वास्थ्य अनुदान HL095722 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
Riferimenti
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