Análisis sistemático de<em> In Vitro</em> Celda balanceo Utilizando un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos
Summary
En este estudio se utilizó un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos, aumentando significativamente el rendimiento de los estudios de laminación celular bajo flujo cortante fisiológicamente relevante. Dada la importancia de la laminación celular en la célula de múltiples pasos homing cascada y la importancia de homing de las células después de la entrega sistémica de las poblaciones de células exógenas en los pacientes, este sistema ofrece un potencial como una plataforma de cribado para mejorar la terapia basada en células.
Abstract
Un reto importante para la terapia basada en células es la incapacidad para apuntar sistémicamente una gran cantidad de células viables con una alta eficiencia a los tejidos de interés después de la infusión intravenosa o intraarterial. En consecuencia, el aumento de homing de células se estudia en la actualidad como una estrategia para mejorar la terapia celular. Celular a rodar sobre el endotelio vascular es un paso importante en el proceso de homing de las células y se puede probar in vitro usando una cámara de flujo de placas paralelas (PPFC). Sin embargo, esta es una, ensayo bajo rendimiento extremadamente tedioso, con condiciones de flujo mal controlados. En lugar de ello, se utilizó un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos que permite el estudio de las propiedades de laminación celular en un rendimiento superior bajo controlada con precisión, por flujo de cizallamiento fisiológicamente relevante 1,2. En este trabajo, se muestra cómo las propiedades de rodadura de HL-60 (leucemia promielocítica humana) en las superficies de las células E-selectina recubierto P-y al igual que en las superficies de una sola capa con recubrimiento de células pueden ser readilY examinó. Para simular mejor las condiciones inflamatorias, la superficie del canal microfluídico se revistió con células endoteliales (EC), que luego se activaron con factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), aumentando significativamente interacciones con células HL-60 bajo condiciones dinámicas. El rendimiento mejorado y multi-plataforma de análisis de parámetros de software integrado, que permite un rápido análisis de parámetros tales como la laminación velocidades y el camino de rodadura, son ventajas importantes para evaluar las propiedades de celda Rolling In-vitro. Permitiendo el análisis rápido y preciso de los enfoques de ingeniería diseñados para impactar de laminación celular y homing, esta plataforma puede ayudar a la terapia basada en células exógeno antelación.
Introduction
Uno de los principales retos en la traducción clínica de éxito de la terapia basada en células es la entrega ineficiente o la orientación de las células infundidas por vía sistémica a los sitios deseados 3,4. En consecuencia, hay una búsqueda constante de métodos para mejorar homing de células y célula específicamente a rodar, como una estrategia para mejorar la terapia celular. Celular rodando en los vasos sanguíneos es un paso clave en la cascada de homing de células, clásicamente definida para los leucocitos que son reclutados a sitios de la enfermedad 5. Este paso se rige por interacciones específicas entre las selectinas del endotelio, es decir, P-y E-selectina sus ligandos contador en la superficie de los leucocitos 5,6 (P-y E-SEL), y. Una mejor comprensión y una mejor eficiencia de homing de las células, y específicamente la etapa de laminación, son de gran importancia en la búsqueda de nuevas plataformas para mejorar la terapia basada en células. Hasta la fecha esto se ha logrado mediante el uso de cámaras de flujo de placa paralelos (PPFCs), que comprende dos plat planaES con una junta entre ellos, con un puerto de flujo de entrada y flujo de salida situado en la placa superior, a través del cual una suspensión de células se perfunde mediante el uso de una bomba de jeringa de 7,8, 9. La superficie de la placa inferior puede estar recubierto con una monocapa de células / sustratos relevantes y la interacción entre las células perfundidos y la superficie bajo flujo de cizallamiento es entonces exploró 7. Sin embargo, PPFC es un rendimiento bajo, reactivo de consumo y el método bastante tedioso, con la formación de burbujas, las fugas, y el flujo de un mal control de la presentación de los principales inconvenientes.
Una técnica alternativa a la PPFC tradicional es un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos, lo que permite un mayor rendimiento rendimiento de ensayos celulares (hasta 10 veces más alta que PPFCs) bajo, flujo preciso de cizallamiento controlado por ordenador, con un bajo consumo de reactivos 1,10. Experimentos de rodadura de la célula se llevan a cabo dentro de los canales microfluídicos, que puede ser recubierto con monocapas de células o sustratos de ingeniería y la imagen USIng un microscopio, con propiedades de rodadura analizó fácilmente utilizando un software adecuado. En este estudio, hemos demostrado las capacidades de este sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos mediante el estudio de las propiedades de rodadura de (HL-60) las células en diferentes superficies de la leucemia promielocítica humana. HL-60 que rueda sobre sustratos como, se analizó P-y E-SEL, así como sobre monocapas de células que expresan diferentes receptores de rodadura. Además, el anticuerpo (Ab) de bloqueo se utiliza para demostrar la participación directa de selectinas específicos en la mediación del movimiento de rodadura de HL-60 en esas superficies. Experimentos de laminación se realizaron con mayor rendimiento, bajo un flujo estable al cizallamiento, con el mínimo consumo de reactivos / célula, permitiendo el análisis eficiente de los parámetros de rodadura clave como la velocidad de rotación, el número de células que ruedan y ruedan propiedades de la ruta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno de los principales retos en la traducción exitosa de la terapia basada en células exógena es la incapacidad de entregar eficientemente las células a los sitios de lesión y la inflamación con una alta eficiencia de injerto 3. Laminación celular representa un paso crítico en el proceso de homing de células, facilitando la desaceleración de las células en las paredes de los vasos sanguíneos, llevando eventualmente a su firme adhesión y la transmigración a través del endotelio hacia el tejido <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Células CHO-P fueron una especie de regalo de la Dra. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención HL095722 a JMK Este trabajo también fue apoyado en parte por una Fundación de Cáncer de Próstata Premio Movember-Desafío a JMK
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
Riferimenti
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