تحريض الغازية سرطان المثانة الانتقالية الخليوي في المناعة السليمة الإنسان MUC1 الفئران المعدلة وراثيا: نموذج للتنمية الخلايا الجذعية
Summary
وN-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين التي يسببها تم تطوير نموذج سرطان المثانة في الميوسين الإنسان 1 (MUC1) الفئران المعدلة وراثيا لغرض اختبار MUC1 العلاج المناعي الموجه. بعد بالإدارة لقاح الببتيد MUC1 المستهدفة، وأكد استجابة الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا لMUC1 من خلال قياس مستويات خلوى المصل ونشاط محدد تي خلية.
Abstract
وقد تم تطوير نموذج ما قبل السريرية لسرطان المثانة الغازية في الميوسين الإنسان 1 (MUC1) المعدلة وراثيا (MUC1.Tg) الفئران لغرض تقييم العلاج المناعي و / أو العلاج الكيميائي السامة للخلايا. للحث على سرطان المثانة، C57BL / 6 الفئران (نوع MUC1.Tg والبرية) وعولج شفويا مع مسرطن N-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين (OH-BBN) في 3.0 ملغ / يوم، 5 أيام / الأسبوع لمدة 12 أسبوعا. لتقييم آثار OH-BBN على ملف خلوى المصل خلال تطوير الورم، وقد تم جمع الدم كله عبر ينزف تحت الفك السفلي قبل العلاج وكل أربعة أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، كانت تدار لقاح الببتيد MUC1 استهداف وهمي لمجموعات من الفئران أسبوعي لمدة ثمانية أسابيع. أجريت متعددة immunoanalyses microbead فلوروميتريك من السيتوكينات في مصل الدم أثناء تطوير ورم والتطعيم التالي. في الإنهاء، انترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) / انترلوكين 4 (IL-4) تحليل ELISPOT لMUC1 محددة الاستجابة المناعية T-خلية والتقييمات الأنسجة من نوع الورموأجريت الصف. أظهرت النتائج ما يلي: (1) كانت نسبة حدوث سرطان المثانة في كلا MUC1.Tg والبرية نوع الفئران 67٪، (2) سرطان الخلايا الانتقالية (TCC) وضعت في نسبة 2:1 مقارنة مع سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) ، (3) زيادة السيتوكينات الالتهابية مع الوقت خلال تطوير الورم، و (4) إعطاء اللقاح الببتيد يؤدي الى TH1 الاستقطاب الشخصي خلوى المصل وMUC1 محددة استجابة خلايا T. وكانت جميع الأورام في الفئران MUC1.Tg إيجابية لMUC1 التعبير، وكانت نصف جميع الأورام في MUC1.Tg والبرية نوع الفئران الغازية. وفي الختام، وذلك باستخدام نهج الفريق من خلال تنسيق جهود الصيادلة، مناعة، علم الأمراض والأحياء الجزيئية، قمنا بتطوير نموذج سليمة الماوس المعدلة وراثيا المناعي للسرطان المثانة التي تعبر عن hMUC1.
Introduction
سرطان المثانة هو الشكل الأكثر شيوعا من سرطان الرابعة والسبب الرئيسي الثامنة لوفيات السرطان في الرجال الأمريكيين. في الولايات المتحدة، ومن المتوقع بين الرجال والنساء جنبا إلى جنب في عام 2013 ما يقدر ب 1 72،500 حالة جديدة و 15،000 حالة وفاة بسبب سرطان المثانة. حالات الإصابة بسرطان المثانة هو ما يقرب من ثلاثة أضعاف في الرجال مقارنة بالنساء. في الولايات المتحدة، سرطان الخلايا الانتقالية (TCC) تمثل أكثر من 90٪ من الحالات، في حين أن سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) لديها معدل أقل من 2٪ 2. النسبية معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات شاملة لTCC حليمي هو 91.5٪ مقارنة مع 30.9٪ فقط لSCC 2. على الرغم من أن البلدان المساهمة بقوات حليمي موسع تمثل حوالي 75٪ من الحالات في وقت التشخيص، حتى مع العلاج أكثر من 50٪ من المرضى سوف تشهد تكرار في غضون 5 سنوات، مع ما يصل إلى 30٪ من هؤلاء المرضى يتقدم إلى العضلات مرض الغازية 3،4 . نظم المعالجة النموذجية للالجرد غير العضلاتتشمل أمراض asive بتر عبر الإحليل (تركيا)، يليه العلاج الكيميائي داخل المثانة. في المرضى الذين يعانون من تا عالية الجودة أو الأورام T1، قد يتم تنفيذ تكرار TUR قبل العلاج الكيميائي 3،4. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من تكرار تا بدرجة منخفضة أو تا عالية الجودة أو آفات T1، والطور يليها العلاج الكيميائي المواد المساعدة أو العلاج المناعي في شكل عصيات كالميت غيران (BCG) يمكن أن تستخدم 3،4. وقد تبين BCG داخل المثانة لتكون متفوقة على إينترفسكل ميتوميسين C مع الاحترام لآخر لتكرار 5. لعضلة T2 المرض الغازية، استئصال المثانة الجذري مع أو بدون العلاج الكيميائي المواد الجديدة المساعدة هو المسار الموصى بها من العلاج 3. في المرضى الذين يعانون من SCC، استئصال المثانة الجذري يبدو أن العلاج الأكثر فعالية 6. وبالنظر إلى معدلات عالية جدا من تكرار على الرغم من أفضل العلاجات المتوفرة، ومن الواضح أن هناك حاجة لعلاجات جديدة وأكثر فعالية لسرطان المثانة.
توسيع المناعية جديدة للbladdإيه السرطان هو أحد النهج الممكنة التي قد تبشر لتمديد بقاء خالية من الأمراض. تاريخيا، كان BCG الخلايا الجذعية الوحيد الفعال لسرطان المثانة. ويعتقد أن آلية عملها لتشمل تحريض غير محدد من نوع تي المساعد 1 (TH1) الاستجابة المناعية عن طريق زيادة مستويات انترلوكين 2 (IL-2) والانترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) 4. الخلوية، أو TH1 الحصانة، أمر بالغ الأهمية في العلاج المناعي السرطان كما الخلطية، أو TH2، ولم يثبت قط الحصانة لتكون فعالة ضد الأورام الصلبة، مع استثناء من الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات عامل النمو 7. في محاولة لتحسين بناء على فوائد BCG حيد، تم تقييم الإنترفيرون α 2B/BCG تركيبة الخلايا الجذعية في التجارب السريرية المرحلة الثانية مع نتائج غير حاسمة 8. نهج بديل لزرع الخلايا الجذعية لسرطان المثانة قد تكون لاستهداف مستضدات الأورام المرتبطة (TAAS)، وتحديد والتي جعلت الخلايا الجذعية السرطانية أكثر تحديدا 7 </sتصل>.
واحدة من هذه TAA هو الميوسين 1 (MUC1)، وهو بروتين سكري سطح الخلية بإفراط (overexpressed) في العديد من أنواع السرطان الخلايا الظهارية مثل المثانة والثدي والرئة، وسرطان البنكرياس 9،10. أيضا يتم تبديل التعبير وتعديل MUC1 بشكل كبير خلال التسرطن، بحيث underglycosylation يعرض تسلسل الأنتيجين من الأحماض الأمينية المعروفة باسم عدد متغير من يكرر جنبا إلى جنب (VNTR) على جوهر الببتيد. بينما MUC1 هو جزيء النفس، لا تتعرض هذه المناطق VNTR سائد مناعيا عادة بسبب ارتباط بالغليكوزيل واسعة، وبالتالي ينظر إليهم من قبل النظام المناعي كما 11،12 الأجنبية. تم السامة للخلايا T-الخلايا الليمفاوية (CTLs) التي تعترف على وجه التحديد MUC1 الحواتم معزولة عن ورم الغدد الليمفاوية استنزاف لمرضى سرطان الثدي 13، وكذلك الدم ونخاع العظام للمرضى المايلوما 14،15، مما يجعل MUC1 هدفا محتملا ل الاستجابة المناعية الخلوية. وVNTRs سائد مناعيا من underglycosylateيتم التعرف على شكل D من MUC1 بواسطة CTLs، مما أدى إلى تدمير الخلايا السرطانية 16-19. الأم الاستجابات المناعية الخلوية و / أو الخلطية إلى MUC1 سرطانية، ومع ذلك، ليست قوية بما فيه الكفاية للقضاء على الأورام. لزيادة ضعف الاستجابة المناعية الموجودة بالفعل لMUC1، ويمكن إدخال الببتيدات سائد مناعيا الاصطناعية من خلال التطعيم لتوليد استجابة CTL قوية بما فيه الكفاية لتكون ذات فائدة سريرية 18،20. وقد تبين بالفعل هناك لقاح الليبوسومال MUC1 لزيادة البقاء على قيد الحياة في مرضى سرطان الرئة 21،22، وتوليد CTLs قادرة على قتل الخلايا السرطانية إيجابية MUC1، وإنتاج رد فعل خلوى TH1 الاستقطاب 23،24. مع مستوى عال من MUC1 التعبير 9،11،25، وسرطان المثانة هو المرشح المنطقي لاختبار MUC1 العلاج المناعي الموجه 26،27. وعلاوة على ذلك، MUC1 لديها امكانات كعامل النذير في سرطان المثانة 28، MUC1 التعبير في TCC يرتبط بشكل كبير مع المرحلة والصف، والنقيلي TCCوقد تبين أن يواصل التعبير عن MUC1 29.
من أجل تقييم الفائدة المحتملة من العلاج المناعي الموجه MUC1 في سرطان المثانة، وضعنا على MUC1 الإنسان سليمة المناعي (hMUC1)، معربا عن المعدلة وراثيا (MUC1.Tg) نموذج الفأر من مسانج سرطان المثانة على C57BL / 6 خلفية 30. وأعرب عن MUC1 الإنسان باعتبارها من البروتين الذاتي تحت سيطرة المروج الخاصة بها، مما أدى إلى نمط التعبير الأنسجة متسقة مع تلك التي لوحظت في البشر 30،31. وقد حثت الفئران مع المثانة مسرطنة معروفة N-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين (OH-BBN) 32، ثم تم تقييم الأورام الناتجة عن hMUC1 التعبير ونوع الورم والصف. لتقييم تأثير مسرطن على Th1/Th2 مستويات خلوى خلال تطوير الورم، تم جمع عينات من مصل الدم بصورة دورية للتحليل المتعدد. ثم عولجت الفئران مع لقاح الببتيد MUC1 المستهدفة، وكانت خلوى المصل والاستجابات المناعية EVALUAتيد بواسطة متعدد فلوروميتريك المناعية microbead وELISPOT.
Protocol
Representative Results
Discussion
والاستقراء الناجح الغازية سرطان الخلايا الحرشفية والمثانة الانتقالية في الفئران MUC1.Tg الإنسان يقدم نموذجا قبل السريرية للتنمية الخلايا الجذعية. تتطلب دراسات Immunotherapeutic استخدام عفوية، نموذج سليمة المناعي من أجل تقييم الاستجابة الالتهابية لتطور الورم على مر الزمن، ف?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ديفيس برنامج علم الأحياء ماوس UC لتربية الفئران. وأيد هذا البحث من خلال منحة من ميرك، دارمشتات، ألمانيا.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
Riferimenti
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
