Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung
Summary
Ein N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin-induzierten Blasenkrebs Modell wurde in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgenen Mäusen zur Prüfung MUC1-gerichtete Immuntherapie entwickelt. Nach Verabreichung eines MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt wurde eine zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion auf MUC1 durch Messung Serum Cytokinspiegel und T-Zell-spezifische Aktivität bestätigt.
Abstract
Einem präklinischen Modell von Harnblasenkarzinom in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgene (MUC1.Tg) Mäuse für den Zweck der Bewertung Immuntherapie und / oder zytotoxische Chemotherapie entwickelt. Um Blasenkrebs, C57BL / 6 Mäuse (MUC1.Tg und Wildtyp) wurden oral mit dem Karzinogen N-Butyl-N-(4-hydroxybutyl) Nitrosamine (OH-BBN) bei 3,0 mg / Tag behandelt, 5 Tage / Woche induzieren für 12 Wochen. Um die Auswirkungen der OH-BBN auf Serum-Zytokin-Profil während der Tumorentwicklung zu bewerten, wurde Vollblut über submandibular blutet vor der Behandlung und alle vier Wochen gesammelt. Außerdem wurden ein MUC1-Peptid-Impfstoff gezielte und Placebo Gruppen von Mäusen wöchentlich acht Wochen lang verabreicht. Multiplex fluorometrische Mikrokügelchen immunoanalyses von Serum Zytokine während der Tumorentwicklung und nach der Impfung durchgeführt. Bei Beendigung, Interferon-gamma (IFN-γ) / Interleukin-4 (IL-4) ELISpot Analyse für MUC1 spezifischen T-Zell-Immunantwort und histopathologischen Auswertungen der Tumorartund Grad durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass: (1) das Vorkommen von Blasenkrebs in beide MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen betrug 67%, (2) Übergangsregelung Karzinome (TCC) im Verhältnis 2:1 entwickelt, um Plattenepithelkarzinome (SCC) im Vergleich , (3) inflammatorische Zytokine mit der Zeit während der Tumorentwicklung erhöht, und (4) Verwaltung des Peptid-Impfstoff induziert eine Th1-polarisierten Serum Zytokinprofil und MUC1 spezifischen T-Zell-Antwort. Alle Tumoren in Mäusen MUC1.Tg waren für MUC1 Ausdruck positiv, und die Hälfte aller Tumoren in MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen waren invasiv. Abschließend mit einem Team-Ansatz durch die Koordinierung der Bemühungen der Pharmakologen, Immunologen, Pathologen und Molekularbiologen haben wir ein Immunsystem intakt transgenen Mausmodell von Blasenkrebs, die hMUC1 Ausdruck entwickelt.
Introduction
Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart und die achte häufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs bei amerikanischen Männern. In den Vereinigten Staaten sind schätzungsweise 72.500 Neuerkrankungen und 15.000 Todesfällen von Blasenkrebs bei Männern und Frauen im Jahr 2013 1 kombiniert erwartet. Die Inzidenz von Blasenkrebs ist etwa dreimal so hoch bei Männern als bei Frauen. In den Vereinigten Staaten, Konto Übergangszeit Karzinome (TCC) für über 90% der Fälle, während Plattenepithelkarzinome (SCC) eine Inzidenz von weniger als 2% 2 haben. Der gesamte relative 5-Jahres-Überlebensrate für papilläre TCC ist 91,5% im Vergleich zu nur 30,9% für 2 SCC. Obwohl invasiven papillären TCCs entfallen rund 75% der Fälle zum Zeitpunkt der Diagnose, Behandlung sogar mit mehr als 50% der Patienten ein Rezidiv innerhalb von 5 Jahren zu erleben, mit bis zu 30% dieser Patienten voran zu Muskel-invasive Erkrankungen 3,4 . Typische Behandlungsschemata für Nicht-Muskel-invAsive Krankheit sind transurethrale Resektion (TUR) durch intravesical Chemotherapie. Bei Patienten mit hochgradigen Ta oder T1-Tumoren kann eine Wiederholung TUR vor der Chemotherapie 3,4 durchgeführt werden. Für jene Patienten mit low-grade Ta Rezidiven oder hochwertigem Ta oder T1-Läsionen, gefolgt von TUR adjuvante Chemotherapie oder Immuntherapie in Form von Bacillus Calmette-Guerin (BCG) 3,4 verwendet werden können. BCG hat sich gezeigt, überlegen zu sein intravesical Mitomycin C mit Bezug auf die Zeit, um eine Wiederholung 5. Für T2 Muskel invasive Erkrankungen, ist die radikale Zystektomie mit oder ohne neoadjuvante Chemotherapie die empfohlene Kur 3. Bei Patienten mit SCC erscheint Zystektomie die effektivste Behandlung 6 sein. Angesichts der sehr hohen Raten von Rückfällen trotz der besten Behandlungen zur Verfügung, es ist eindeutig ein Bedarf für neue, effektivere Therapien für Blasenkrebs.
Ausbau neuer Immuntherapien zur abgeschlossenem Satzer Krebs ist ein möglicher Ansatz, die Versprechen für die Verlängerung des krankheitsfreien Überlebens halten kann. Historisch gesehen hat BCG die einzige effektive Immuntherapie für Blasenkrebs. Seine Wirkungsweise wird angenommen, dass die nicht-spezifische Induktion einer T-Helfer 1 (Th1) die Immunantwort durch die Erhöhung des Niveaus von Interleukin-2 (IL-2) und Interferon gamma (IFN-γ) 4 umfassen. Zelluläre oder Th1 Immunität, ist kritisch in Krebs-Immuntherapie als humorale oder Th2 hat Immunität nie als wirksam gegen feste Tumoren, mit Ausnahme von Antikörpern gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren 7 gerichtet. In einem Versuch, auf die Vorteile der BCG-Monotherapie zu verbessern, wurde IFN-α 2B/BCG Kombination Immuntherapie in einer klinischen Phase-II-Studie mit eindeutigen Ergebnisse 8 bewertet. Ein alternativer Ansatz zur Immuntherapie für Blasenkrebs sein kann, um Tumor-assoziierte Antigene (TAA), die Identifizierung von denen gemacht Krebsimmuntherapie präziser 7 hat gezielt </sup>.
Eine solche TAA Mucin 1 (MUC1), der ein Zelloberflächen-Glykoprotein in vielen epithelialen Tumoren wie Blasen-, Brust-, Lungen-und Bauchspeicheldrüsenkrebs 9,10 überexprimiert ist. Die Expression und Modifikation von MUC1 auch im wesentlichen während der Karzinogenese verändert, macht, dass underglycosylation antigene Sequenzen von Aminosäuren, wie variable Anzahl von Tandem-Repeats (VNTR) auf dem Peptid Kern bekannt. Während MUC1 ist ein selbst-Molekül sind diese immundominante VNTR-Regionen in der Regel nicht durch umfangreiche Glykosylierung ausgesetzt, und somit werden sie vom Immunsystem als fremd 11,12 gesehen. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die spezifisch erkennen MUC1-Epitope aus den Tumor-Lymphknoten von Brustkrebspatientinnen 13 sowie Blut und Knochenmark von Myelom-Patienten isoliert wurden 14,15, so dass MUC1 ein potentielles Ziel für eine zellulären Immunantwort. Die immundominante VNTRs der underglycosylated Form von MUC1 durch CTLs erkannt wird, was die Zerstörung von Tumorzellen 16-19. Native zelluläre und / oder humorale Immunantwort gegen Krebs MUC1 sind jedoch nicht stark genug, um Tumoren zu eliminieren. Um die bereits bestehende schwache Immunantwort auf MUC1 vermehren können synthetische Peptide immundominante durch Impfung eingeführt werden, um eine CTL-Reaktion stark genug, um einen klinischen Nutzen zu generieren 18,20 sein. Ein MUC1 liposomalen Impfstoff wurde bereits gezeigt, dass das Überleben bei Patienten mit Lungenkrebs 21,22 zu erhöhen, erzeugen CTLs, die töten MUC1-positive Tumorzellen, und produzieren eine Th1-polarisierten Zytokinantwort 23,24. Mit einer hohen Expression von MUC1 9,11,25, Blasenkrebs ist ein logischer Kandidat für die Prüfung MUC1 gerichtet Immuntherapie 26,27. Ferner weist MUC1 Potential als prognostischer Faktor in Blasenkrebs 28. MUC1-Expression in TCC signifikant Stadium und Grad zugeordnet ist, und metastatischen TCCEs wurde gezeigt, weiterhin MUC1 29 auszudrücken.
Um die potentielle Nützlichkeit von MUC1-gerichtete Immuntherapie bei Blasenkrebs auszuwerten, haben wir eine intakte menschliche Immunsystem MUC1 (hMUC1)-exprimierenden transgenen (MUC1.Tg) Mausmodell von Blasenkrebs congenic auf der C57BL / 6 Hintergrund 30. Menschliche MUC1 ist als selbsttragende Protein unter der Kontrolle seines eigenen Promotors, was zu einer Gewebe-Expressionsmuster mit dem von Menschen beobachtet 30,31 ausgedrückt. Die Mäuse wurden mit dem bekannten Blase Karzinogen N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin (OH-BBN) 32, und dann die resultierenden Tumoren wurden hMUC1 Expression und Tumorart und Note bewertet induziert. Um die Wirkung des karzinogen auf Th1/Th2 Cytokinspiegel während der Tumorentwicklung zu untersuchen, wurden Serumproben regelmäßig für Multiplex-Analyse gesammelt. Die Mäuse wurden dann mit einer MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt behandelt, und das Serum von Cytokinen und Immunantworten Auswertungted von Multiplex-Immunoassay fluorometrische Mikrokügelchen und ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die erfolgreiche Induktion von Übergangs-und invasive Plattenepithelkarzinome Blasenkarzinom in menschlichen MUC1.Tg Mäuse bietet eine Immuntherapie präklinischen Modell für Entwicklung. Immunotherapeutic Untersuchungen erfordern die Verwendung eines spontanen, Immunsystem intakt Modell, um die entzündliche Reaktion auf Tumorprogression im Laufe der Zeit als auch der Immunantwort auf eine Immuntherapie zu bewerten. In einer spontanen Tumorentwicklung Modell bleibt der Tumor-Mikroumgebung intakt und die Tumore entwi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die UC Davis Mausbiologie Programm für die Zucht der Mäuse danken. Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland unterstützt.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
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