Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia
Summary
Um N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzida pelo modelo de cancro da bexiga foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) ratinhos transgénicos para o fim de testar a MUC1-imunoterapia dirigida. Após a administração de uma vacina de péptido MUC1-alvo, uma resposta de linfócitos T citotóxicos para MUC1 foi confirmada por medição dos níveis de citocinas no soro e da actividade específica da célula T.
Abstract
A modelo pré-clínico de câncer de bexiga invasivo foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) camundongos transgênicos (MUC1.Tg) com a finalidade de avaliar a imunoterapia e / ou quimioterapia citotóxica. Para induzir o cancro da bexiga, C57BL / 6 (tipo selvagem e MUC1.Tg) foram tratados oralmente com o agente cancerígeno de N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / dia, 5 dias / semana durante 12 semanas. Para avaliar os efeitos de OH-BBN no perfil de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor, sangue foi coletado por meio de hemorragias submandibular antes do tratamento ea cada quatro semanas. Além disso, uma vacina de péptido MUC1-alvo e um placebo foram administrados a grupos de ratinhos por semana durante oito semanas. Multiplex fluorométricos immunoanalyses microbead de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor e após a vacinação foram realizadas. No término, o interferão gama (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análise ELISpot para MUC1 resposta imunitária das células T específicas e as avaliações histológicas do tipo de tumore grau foram realizados. Os resultados mostraram que: (1) a incidência de câncer de bexiga em ratos tipo tanto MUC1.Tg e selvagem foi de 67%, (2) carcinomas de células transicionais (TCC) desenvolvidos na proporção de 2:1 em relação ao carcinoma de células escamosas (SCC) , (3) as citocinas inflamatórias aumentou com o tempo, durante o desenvolvimento do tumor, e (4) a administração do péptido de vacina induz um perfil de citocinas Th1 soro polarizado e uma resposta de células T específica MUC1. Todos os tumores em MUC1.Tg camundongos foram positivos para MUC1 expressão, e metade de todos os tumores em camundongos tipo MUC1.Tg e selvagens foram invasivo. Em conclusão, utilizando uma abordagem de equipe, através da coordenação dos esforços dos farmacologistas, imunologistas, patologistas e biólogos moleculares, desenvolvemos um modelo de camundongo transgênico imune intacto de câncer de bexiga que expressa hMUC1.
Introduction
O câncer de bexiga é o quarto tipo mais comum de câncer ea oitava causa de morte por câncer em homens americanos. Nos Estados Unidos, estima-se 72.500 novos casos e 15.000 mortes por câncer de bexiga são esperados entre homens e mulheres juntos em 2013 1. A incidência de câncer de bexiga é aproximadamente três vezes maior nos homens em relação às mulheres. Nos Estados Unidos, os carcinomas de células transicionais (TCC) são responsáveis por mais de 90% dos casos, enquanto os carcinomas espinocelular (CEC) têm uma incidência de menos de 2% 2. A taxa de sobrevida em 5 anos relativo global para papilar TCC é de 91,5% em comparação com apenas 30,9% para o SCC 2. Embora TTCs papilares não invasivos representam aproximadamente 75% dos casos no momento do diagnóstico, mesmo com o tratamento de mais de 50% dos pacientes experimentam a recorrência dentro de 5 anos, com um máximo de 30% destes pacientes a progredir para doença invasiva do músculo 3,4 . Regimes de tratamento típicas para inv não-músculodoença ASIVE incluem a ressecção transuretral (TUR), seguido de quimioterapia intravesical. Em pacientes com Ta de alto grau ou tumores T1, um TUR repetição pode ser realizada antes da quimioterapia 3,4. Para os pacientes com recidiva Ta de baixo grau ou de alto grau de Ta ou lesões T1, TUR seguido por quimioterapia adjuvante, imunoterapia ou na forma de Bacilo Calmette-Guerin (BCG), podem ser utilizados 3,4. Intravesical BCG tem sido mostrado para ser superior ao intravesical mitomicina C no que diz respeito ao tempo de recorrência 5. Para doença invasiva muscular T2, cistectomia radical com ou sem quimioterapia neoadjuvante é o curso de tratamento recomendado 3. Em pacientes com SCC, cistectomia radical parece ser o tratamento mais eficaz 6. Dadas as altas taxas de reincidência, apesar dos melhores tratamentos disponíveis, existe claramente uma necessidade de terapias novas e mais eficazes para o câncer de bexiga.
Ampliação de novos immunotherapies para bladdcâncer er é uma abordagem possível, que podem ser uma esperança para prolongar a sobrevivência livre de doença. Historicamente, a BCG tem sido a única imunoterapia para o câncer de bexiga. O seu mecanismo de acção está pensado para envolver a indução não específica de uma resposta imunitária de tipo T helper 1 (Th1), através de aumento dos níveis de interleucina-2 (IL-2) e interferão gama (IFN-γ) 4. Celular, ou a imunidade de Th1, é crítico na imunoterapia do cancro como humoral, ou Th2, a imunidade nunca foi demonstrado ser eficaz contra tumores sólidos, com excepção de anticorpos dirigidos contra os receptores do factor de crescimento de 7. Na tentativa de melhorar os benefícios da BCG monoterapia, IFN-α 2B/BCG combinação de imunoterapia foi avaliada em um ensaio clínico de fase II com resultados inconclusivos 8. Uma abordagem alternativa para a imunoterapia para o câncer de bexiga pode ser alvo antígenos associados a tumores (TAAs), a identificação de que fez imunoterapia do cancro mais específico 7 </sup>.
Um tal AT é a mucina 1 (MUC1), que é uma glicoproteína de superfície celular, em muitos cancros superexpresso de células epiteliais, tais como de bexiga, mama, pulmão, e cancro do pâncreas 9,10. A expressão e modificação da proteína MUC1 também é substancialmente alterada durante a carcinogénese, de tal forma que expõe underglycosylation sequências antigénicas de aminoácidos conhecidas como número variável de repetições em tandem (VNTR) no núcleo do péptido. Enquanto MUC1 é um auto-molécula, essas regiões imunodominantes VNTR não são normalmente expostos devido a uma extensa glicosilação e, assim, eles são vistos pelo sistema imune como 11,12 estrangeira. Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) que reconhecem especificamente MUC1 epitopos tenham sido isolados a partir dos nódulos linfáticos drenantes tumores de pacientes de cancro da mama 13, bem como do sangue e da medula óssea de doentes com mieloma 14,15, tornando MUC1 um alvo potencial para um resposta imune celular. Os VNTRs imunodominantes da underglycosylateforma d de MUC1 são reconhecidas pelas CTLs, resultando na destruição de células tumorais 16-19. As respostas imunes celulares e / ou humorais nativas para MUC1 cancerosas são, no entanto, não é suficientemente forte para eliminar tumores. Para aumentar a resposta imune fraca já existente para MUC1, os péptidos imunodominantes sintéticos podem ser introduzidas através de vacinação para gerar uma resposta de CTL forte o suficiente para ser de benefício clínico 18,20. Uma vacina lipossomal MUC1 já foi mostrada para aumentar a sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão 21,22, gerar CTL capazes de matar as células do tumor MUC-1-positivos, e produzir uma resposta de citocinas tipo Th1 polarizadas 23,24. Com um nível elevado de expressão de MUC-1 9,11,25, cancro da bexiga é um candidato lógico para testar a MUC1 dirigida imunoterapia 26,27. Além disso, a MUC1 tem potencial como fator prognóstico no câncer de bexiga 28, MUC1 expressão em TCC está significativamente associado com o estágio e grau, e metastático TCCFoi demonstrado que continuam a expressar MUC1 29.
A fim de avaliar o potencial utilidade da imunoterapia MUC1 dirigida no cancro da bexiga, foi desenvolvido um MUC-1 humano intacto imune (hMUC1)-expressando Congênicos transgénico modelo de cancro da bexiga de rato (MUC1.Tg) no C57BL / 6 do fundo 30. MUC-1 humana expressa-se como uma auto-proteína sob o controlo do seu próprio promotor, resultando num padrão de expressão do tecido consistente com a observada em humanos 30,31. Os ratinhos foram induzidos com a bexiga cancerígeno conhecido N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN), 32, e, em seguida, os tumores resultantes foram avaliados quanto à expressão hMUC1 e tipo de tumor e grau. Para avaliar o efeito do agente cancerígeno sobre os níveis de citocinas Th1/Th2, durante o desenvolvimento do tumor, amostras de soro foram recolhidas periodicamente para análise multiplex. Os ratinhos foram, em seguida, tratou-se com uma vacina de péptido MUC1-alvo, e a citoquina de soro e as respostas imunes foram avated por multiplex fluorometric imunoensaio microbead e ELISpot.
Protocol
Representative Results
Discussion
A indução bem-sucedida de carcinoma de células transicionais da bexiga e escamosas invasivo em ratos MUC1.Tg humanos oferece um modelo pré-clínico para o desenvolvimento de imunoterapia. Estudos imunoteraptico requerem o uso de um modelo espontâneo intacto, imune a fim de avaliar a resposta inflamatória a progressão do tumor ao longo do tempo, bem como a resposta imunitária a imunoterapia. Em um modelo de desenvolvimento de tumores espontâneos, o microambiente do tumor permanece intacta e os tumores se desenvo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Programa de Biologia Rato Davis UC para a reprodução dos ratos. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.
Materials
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper & Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| [header] | |||
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
Riferimenti
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N’-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
