NF-κB निर्भर वयस्क neurogenesis के मॉड्यूलेशन और विश्लेषण के लिए तरीके
Summary
NF-κB निर्भर वयस्क हिप्पोकैम्पस neurogenesis के हेरफेर और विश्लेषण के लिए तरीके से वर्णित हैं. एक विस्तृत प्रोटोकॉल चूहों में संज्ञानात्मक परिणाम की जांच के लिए एक दांतेदार गाइरस निर्भर व्यवहार परीक्षण (स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स उलझन कहा जाता है) के लिए प्रस्तुत किया है. इस तकनीक को भी अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग में जांच के लिए सक्षम मदद करनी चाहिए.
Abstract
हिप्पोकैम्पस प्रासंगिक यादों के गठन और समेकन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, और स्थानिक उन्मुखीकरण में. ऐतिहासिक, वयस्क हिप्पोकैम्पस स्तनधारी मस्तिष्क का एक बहुत स्थिर संरचनात्मक क्षेत्र के रूप में देखा गया है. हालांकि, हाल के निष्कर्षों हिप्पोकैम्पस की दांतेदार गाइरस मौजूदा neuronal सर्किट के संशोधनों, लेकिन यह भी वयस्क neurogenesis न केवल शामिल है, वयस्कों में जबरदस्त plasticity के एक क्षेत्र है कि प्रदर्शन किया है. इस plasticity प्रतिलेखन कारक NF-κB एक प्रमुख भूमिका निभाता है, जटिल transcriptional नेटवर्क के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. वयस्क neurogenesis NF-κB गतिविधि के अग्रमस्तिष्क विशिष्ट neuronal निषेध के लिए एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग किया जा सकता है अध्ययन और हेरफेर.
इस अध्ययन में, तरीकों इसके संरचनात्मक पहलुओं, neuronal apoptosis और पूर्वज प्रसार, और संज्ञानात्मक महत्व है, जो सहित NF-κB निर्भर neurogenesis के विश्लेषण के लिए वर्णित हैंज विशेष रूप से एक दांतेदार गाइरस (डीजी) पर निर्भर व्यवहार परीक्षण, स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स भूलभुलैया (एसपीएस-बी एम) के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था. एसपीएस-बी.एम. प्रोटोकॉल बस वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस पर विशेष जीनों के प्रभाव का आकलन करने के लिए डिजाइन अन्य ट्रांसजेनिक पशु मॉडल के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, एसपीएस-बी.एम. औषधीय एजेंटों का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, डीजी निर्भर सीखने की जांच और जोड़ तोड़ करने के उद्देश्य से अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Ontologically, हिप्पोकैम्पस सबसे पुराना ज्ञात संरचनात्मक मस्तिष्क संरचनाओं में से एक है. यह इस तरह के दीर्घकालिक स्मृति, स्थानिक उन्मुखीकरण, और संबंधित स्मृति के गठन और समेकन के नियमन में निर्णायक कार्यों के रूप में विविध जटिल कार्यों के लिए जिम्मेदार है. Anatomically, हिप्पोकैम्पस अपने subgranular क्षेत्र के भीतर ग्रेन्युल कोशिकाओं और कुछ neuronal progenitors होता है जो श्रृंग एम्मोनिस (सीए 1, CA2, सीए 3, और CA4) क्षेत्रों और दांतेदार गाइरस (गाइरस dentatus), सहित पिरामिड सेल परतों (परत pyramidale) के होते हैं . ग्रेन्युल कोशिकाओं तथाकथित दलदल का फाइबर (ग्रेन्युल कोशिकाओं के axons) के माध्यम से सीए 3 क्षेत्र की ओर परियोजना.
पिछली सदी के अंत तक, वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क सेलुलर plasticity और neurogenesis कमी एक स्थिर अंग माना जा रहा था. हालांकि, पिछले दो दशकों के दौरान, सबूत के एक बढ़ती हुई राशि को स्पष्ट रूप में जगह लेने वयस्क neurogenesis दर्शाता है कम से कमदो मस्तिष्क क्षेत्रों, subventricular क्षेत्र (SVZ) और हिप्पोकैम्पस के subgranular क्षेत्र.
हमारे पिछले अध्ययनों, और अन्य समूहों के उन, प्रतिलेखन कारक NF-κB वयस्क neurogenesis की महत्वपूर्ण आणविक नियामकों में से एक है, और गंभीर संरचनात्मक हिप्पोकैम्पस दोषों और संज्ञानात्मक 1-6 में अपनी de-विनियमन परिणाम है कि पता चला है कि. NF-κB पांच डीएनए बाध्यकारी सब यूनिटों के विभिन्न dimeric संयोजन से बना एक inducible प्रतिलेखन कारक के जेनेरिक नाम है: P50, P52, C-रिलायंस, RelB, और p65 (असली), जिनमें से बाद के तीन transactivation डोमेन है. मस्तिष्क के भीतर, कोशिका द्रव्य में पाया सबसे प्रचुर रूप P50 और रूई बी (IκB) प्रोटीन का अवरोध करनेवाला द्वारा एक निष्क्रिय फार्म में रखा जाता है जो p65, के एक heterodimer है.
NF-κB संचालित न्यूरोजेनेसिस अध्ययन और सीधे हेरफेर करने के लिए, हम NF-κB subun का सब से सरल निषेध सक्षम करने के लिए ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोगअपनी, विशेष रूप से अग्रमस्तिष्क 7 (1 चित्र देखें). और -/tTA – इस प्रयोजन के लिए, हम निम्नलिखित ट्रांसजेनिक माउस लाइनों, IκB / पार से पैदा की. ट्रांसजेनिक IκB / – लाइन NF-κB अवरोध करनेवाला IκBa (सुपर repressor IκBa-AA1) के एक पार प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था 8. जंगली प्रकार IκBα के विपरीत, IκBα-AA1 अवरोध करनेवाला की phosphorylation और बाद proteasomal गिरावट में बाधा जो alanines (V32 और V36), उत्परिवर्तित दो सेरीन अवशेष है. IκBa-AA1-transgene की अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन विशेष अभिव्यक्ति के लिए, IκB / – चूहों चूहों एक कैल्शियम calmodulin निर्भर kinase को शरण देने के साथ पार नस्ल थे IIα टेट्रासाइक्लिन पार उत्प्रेरक (TTA) द्वारा संचालित किया जा सकता है कि (CAMKIIα) प्रमोटर 9.
p65 नाक आउट चूहों की वजह से बड़े पैमाने पर जिगर apoptosis 10, एक भ्रूण घातक phenotype है, तो यहाँ दिखाया दृष्टिकोण एक सुंदर तरीका प्रदान करता हैप्रसव के बाद और वयस्क neurogenesis में NF-κB की भूमिका की जांच के लिए.
स्थानिक सीखने और स्मृति अध्ययन करने के लिए क्लासिक व्यवहार परीक्षण रिचर्ड मॉरिस, मॉरिस पानी भूलभुलैया (MWM) 11 के रूप में जाना एक परीक्षण द्वारा 1980 के दशक में वर्णित किया गया था. इस खुले मैदान पानी भूलभुलैया में, जानवरों अभिविन्यास और अतिरिक्त भूलभुलैया cues पर आधारित एक छिपा मंच पर अपारदर्शी पानी से बचने के लिए सीख लो. MWM की एक सूखी संस्करण तथाकथित बार्न्स भूलभुलैया (बीएम) 12 है. इस परीक्षा में एक एक से बचने बॉक्स के रूप में परिभाषित किया छेद, और उन्मुखीकरण के लिए दृश्य अतिरिक्त भूलभुलैया cues के साथ, एक प्लेट की सीमा पर व्यवस्था 20 परिपत्र छेद के साथ एक परिपत्र प्लेट का इस्तेमाल करता. दोनों प्रयोगात्मक मानदंड एक कृंतक `के पानी के लिए घृणा, या खुला, चमकीले प्रबुद्ध रिक्त स्थान से प्रेरित उड़ान व्यवहार पर निर्भर हैं. दोनों परीक्षण स्थानिक उन्मुखीकरण की एक जांच, और संबंधित स्मृति प्रदर्शन की अनुमति. हिप्पोकैम्पस स्थानिक स्मृति गठन में एक सामान्य और आवश्यक भूमिका निभाता है, हिप्पोकैम्पस Rशामिल egions लागू परीक्षण के आधार पर अलग. बी.एम. में परीक्षण स्मृति enthorinal प्रांतस्था (ईसी) और डीजी 13-16 के योगदान के बिना हिप्पोकैम्पस के सीए 1 क्षेत्र में स्थित पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच neuronal गतिविधि से उत्पन्न होती है. विशेष रूप से, क्लासिक बी.एम. मुख्य रूप से महत्वपूर्ण बात है, महानिदेशक महत्वपूर्ण प्रसंस्करण की न केवल तात्पर्य जो तथाकथित स्थानिक पैटर्न मान्यता 17, में शामिल है चुनाव आयोग वी. सीए 1 के लिए चुनाव आयोग III से monosynaptic temporo-ammonic मार्ग के माध्यम से नेविगेशन पर निर्भर करता है दृश्य और स्थानिक जानकारी है, लेकिन यह भी भिन्न, nonoverlapping अभ्यावेदन में समान प्रतिनिधित्व या यादों के परिवर्तन. इस कार्य सीए 1 और बी एम 15 में परीक्षण नहीं किया जा सकता है, जो चुनाव आयोग छठी, करने के लिए सीए 3 के लिए डीजी को चुनाव आयोग द्वितीय से एक कार्यात्मक त्रिकोणीय synaptic सर्किट की आवश्यकता है.
इन चुनौतियों का सामना करने के लिए, हम विशेष रूप से सह में दांतेदार गाइरस निर्भर संज्ञानात्मक प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए एक व्यवहार परीक्षण के रूप में एसपीएस-बी.एम. तैयार कर लिया हैntrol जानवरों, और NF-κB निषेध निम्नलिखित IκB / TTA सुपर repressor मॉडल में. महत्वपूर्ण बात है, MWM या बी.एम. के विपरीत, एसपीएस-बी.एम. neurogenesis की हानि से उत्पन्न सूक्ष्म व्यवहार घाटे प्रकट कर सकते हैं. स्थानिक पैटर्न जुदाई चुनाव आयोग द्वितीय और महानिदेशक और सीए 3 और सीए 1 और चुनाव आयोग छठी के बीच एक कार्यात्मक सर्किट पर सख्ती से निर्भर है, इस परीक्षण के भीतर संभावित neurogenesis में बदलाव, काई से भरा फाइबर मार्ग का संशोधन या ऊतक homeostasis के परिवर्तन के लिए बेहद संवेदनशील है महानिदेशक.
तकनीकी तौर पर, हमारे परीक्षण के सेट अप Clelland एट अल द्वारा अध्ययन पर आधारित है., स्थानिक जुदाई पैटर्न एक लकड़ी के 8 हाथ रेडियल भुजा भूलभुलैया (रैम) 19 का उपयोग कर परीक्षण किया गया था जिसमें. हमारे संशोधित सेट अप में, आठ हथियार सात समान पीला भोजन मकानों की जगह थी. संक्षेप में, तरीकों हिप्पोकैम्पस, काई से भरा फाइबर अनुमानों, neuronal सेल डे भीतर doublecortin व्यक्त (DCX +) कोशिकाओं का विश्लेषण सहित, यहाँ दिखाया गया हैएथलीट और विशेष रूप से एसपीएस-बी.एम. यहाँ प्रस्तुत, वयस्क neurogenesis पर प्रभाव पड़ता है कि transgenes शामिल अन्य माउस मॉडल की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा आवेदन औषधीय एजेंटों के अध्ययन और महानिदेशक और स्थानिक पैटर्न जुदाई पर उनके प्रभाव को मापने शामिल हो सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क neurogenesis, और डॉक्सीसाइक्लिन के माध्यम से न्यूरॉन्स में NF-κB का निषेध है, और उसके बाद में पुनः सक्रियण के माध्यम से अपने गड़बड़ी की संभावना, वयस्क मस्तिष्क, साथ ही neuronal डे और पुनः पीढ़ी में में नवजात न्यूर?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एंजेला Kralemann-कोहलर धन्यवाद. यहाँ बताया प्रायोगिक कार्य हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया था और सी.के. और बीके और बीके करने के लिए अनुसंधान और शिक्षा के जर्मन मंत्रालय (BMBF) का अनुदान के लिए जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
Riferimenti
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