Metoder for Modulation og analyse av NF-κB-avhengig Adult Neurogenesis
Summary
Fremgangsmåter for manipulering og analyse av NF-κB avhengig voksen hippocampus neurogenesis er beskrevet. En detaljert protokoll er presentert for en dentate gyrus avhengig atferds test (kalt den romlige mønster separasjon-Barnes labyrint) for undersøkelse av kognitiv utfallet i mus. Denne teknikken bør også bidra til at undersøkelser i andre eksperimentelle innstillinger.
Abstract
Hippocampus spiller en sentral rolle i dannelsen og konsolidering av episodiske minner, og i romlig orientering. Historisk har den voksne hippocampus blitt sett på som en svært statisk anatomisk region av hjernen hos pattedyr. Imidlertid har nyere funn viser at dentate gyrus av hippocampus er et område med enorm plastisitet hos voksne, som involverer ikke bare modifikasjoner av eksisterende nevrale kretser, men også voksen neurogenesis. Denne plastisitet er regulert av komplekse transkripsjonelle nett, hvor transkripsjonsfaktor NF-κB spiller en fremtredende rolle. For å studere og manipulere voksen neurogenesis, en transgen musemodell for forhjerne-spesifikke nevronale hemming av NF-κB aktivitet kan anvendes.
I denne studien, er metoder som er beskrevet for analyse av NF-κB-avhengig neurogenesis, herunder dets strukturelle aspekter, nevronale apoptose og stamfar spredning, og kognitiv betydning, hh ble spesielt vurdert via en dentate gyrus (DG) avhengig atferds test, den romlige mønster separasjon-Barnes labyrint (SPS-BM). SPS-BM-protokollen kan være ganske enkelt tilpasses for bruk med andre transgene dyremodeller er utformet for å bedømme innflytelsen av bestemte gener i voksen hippocampus neurogenesis. Videre kan SPS-BM brukes i andre eksperimentelle innstillinger for å undersøke og manipulere DG avhengig læring, for eksempel ved hjelp av farmakologiske midler.
Introduction
Ontologisk er hippocampus en av de eldste anatomiske strukturer i hjernen kjent. Det er ansvarlig for ulike komplekse oppgaver, som for eksempel sentrale funksjoner i reguleringen av langtidshukommelsen, romlig orientering, og dannelse og konsolidering av de respektive minne. Anatomisk, består hippocampus av pyramidale cellelag (stratum Pyramide) inkludert Cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, og CA4) regioner og dentate gyrus (gyrus dentatus), som inneholder granule celler og noen nevrale stamceller innenfor sitt subgranular sone . Den granule celler projisere mot CA3 regionen via de såkalte mosegrodde fibre (axons av granule celler).
Frem til slutten av forrige århundre, ble den voksne hjernen hos pattedyr antas å være en statisk organ mangler mobilnettet plastisitet og neurogenesis. Men i løpet av de siste to tiårene har en økende mengde bevis viser tydelig voksen neurogenesis finner sted i minstto områder av hjernen, subventricular sone (SVZ) og subgranular sonen av hippocampus.
Våre tidligere studier, og de av andre grupper, har vist at transkripsjonsfaktoren NF-κB er en av de avgjørende molekylære regulatorer av voksen neurogenesis, og at dens de-reguleringen medfører alvorlige strukturelle hippocampus defekter og kognitive svekkelser 1-6. NF-κB er det generiske navn for en induserbar transkripsjonsfaktor sammensatt av forskjellige dimere kombinasjoner av fem DNA-bindende subenheter: P50, P52, c-Rel, relB og P65 (forhold), idet sistnevnte tre av disse har transactivation domener. I hjernen, den mest vanlige formen som finnes i cytoplasma er en heterodimer av p50 og p65, som er holdt i en inaktiv form av inhibitor av kappa B (IκB)-proteiner.
Å studere og direkte manipulere NF-κB-drevet neurogenesis, bruker vi transgene musemodeller for å gi deg enkel hemming av alt av NF-κB subunsin, spesielt i forhjernen 7 (se figur 1). For dette formålet, vi krysser-avlet følgende transgene mus linjer, IκB / – og -/tTA. Den transgene IκB / – linjen ble generert ved hjelp av en trans-dominant negative mutant av NF-κB-hemmer IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8. I motsetning til villtype IκBα, har IκBα-AA1 to serin-rester mutert til alanines (V32 og V36), som hemmer fosforylering og etterfølgende proteasomal nedbrytning av inhibitor. For forhjernen neuron-spesifikk ekspresjon av IκBa-AA1-transgenet, IκB / – mus ble kryss avlet med mus som inneholder et kalsium-calmodulin-avhengig kinase IIα (CAMKIIα)-promoter som kan bli drevet av tetracyklin trans-aktivator (TTA) 9.
P65 knock-out mus har en embryonale dødelig fenotype, på grunn av massive lever apoptose 10, så tilnærmingen vist her gir en elegant metodefor å undersøke rollen av NF-κB i postnatal og voksen neurogenesis.
Den klassiske atferds test for å studere romlig læring og hukommelse ble beskrevet i 1980 av Richard Morris, en test kjent som Morris vann-labyrint (MWM) 11. I denne åpne-feltet vann-labyrint, dyr lærer å flykte fra ugjennomsiktig vann på en skjult plattform basert på orientering og ekstra-labyrint pekepinner. En tørr variant av MWM er den såkalte Barnes labyrint (BM) 12. Denne testen benytter en sirkulær plate med 20 runde hull arrangert på grensen av en plate, med en definert hull som en flukt-boksen, og visuelle ekstra-labyrint pekepinner for orientering. Begge eksperimentelle paradigmer stole på fluktadferd indusert av en gnager `s aversjon mot vann, eller åpne, lyst opplyste områder. Begge testene tillate en undersøkelse av romlig orientering, og den relaterte minneytelse. Selv hippocampus spiller en generell og essensiell rolle i romlig hukommelse formasjonen, hippocampus regions involvert variere avhengig av testen anvendt. Minnet testet i BM oppstår fra nerve-aktivitet mellom enthorinal cortex (EF) og pyramidale nevroner ligger i CA1-regionen i hippocampus uten bidraget fra DG 13-16. Spesielt den klassiske BM hovedsakelig er avhengig av navigasjons via monosynaptisk temporo-ammonic sti fra EF III til CA1 EC V. Viktigere er DG avgjørende involvert i den såkalte romlig mønstergjenkjenning 17, noe som innebærer ikke bare behandling av visuell og romlig informasjon, men også transformasjonen av lignende fremstillinger eller minner inn i ulike, nonoverlapping representasjoner. Denne oppgaven krever en funksjonell tri-synaptiske krets fra EF II til DG til CA3 til CA1 og EC VI, som ikke kan testes i BM 15.
For å møte disse utfordringene, har vi utviklet SPS-BM som et atferdsmessig test for å teste dentate gyrus avhengige kognitive prestasjoner i co spesifiktntrol dyr, og i IκB / TTA super-repressor-modellen etter NF-κB hemming. Viktigere, i motsetning til den MWM eller BM kan SPS-BM avsløre subtile adferdsmessige mangler som følge av svekkelse av neurogenesis. Siden romlig-mønster-separasjon er strengt avhengig av en funksjonell krets mellom EF II og DG og CA3 og CA1 og EC VI, er svært følsom for potensielle endringer i neurogenesis, modifikasjoner av mosegrodd fiberbanevei eller endringer av vev homeostase innenfor denne testen DG.
Teknisk sett er det oppsett av vår test basert på studier av Clelland et al., Der romlig separasjon mønsteret ble testet ved hjelp av en tre åtte-arm radial arm labyrint (RAM) 19. I vår endret set-up, ble de åtte armene erstattet av syv identiske gule mat hus. Oppsummert metodene vist her, inkludert analyse av doublecortin-uttrykk (DCX +) celler i hippocampus, den mosefiberfremspring, neuronal celle death og spesielt SPS-BM presenteres her, kan brukes til undersøkelser av andre musemodeller som omfatter transgener som har en innvirkning på voksen neurogenesis. Andre applikasjoner kan omfatte studier av farmakologiske midler og måle deres innvirkning på DG og romlig mønster separasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voksen neurogenesis, og muligheten for sin manipulasjon via hemming av NF-κB i nevroner, og dens senere reaktivering via doksycyklin, tilbyr en fascinerende system for etterforskning av nyfødte nerveceller i den voksne hjernen, samt i nevronale de-og re-generasjonen . Det fine med dette systemet er at NF-κB signalveien hemming i nevroner ikke bare resultater i endringer i nevronale celledød, stamfar spredning og migrasjon, og alvorlige strukturelle og anatomiske endringer, men også i åpenbare lærings defekter. Vi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Angela Kralemann-Köhler for god teknisk støtte. Eksperimentelt arbeid beskrevet her ble utført i vårt laboratorium og ble støttet med tilskudd av den tyske Research Council (DFG) til CK og BK og et tilskudd av det tyske departementet for forskning og utdanning (BMBF) til BK.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
Riferimenti
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. . Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
