תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
Elegan <em> Caenorhabditis </ em> הוא מודל שימושי כדי לחקור את הפונקציות של חומצות שומן רב בלתי רוויות בפיתוח ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להשלמת ג <em> elegans </ em> דיאטה עם חומצות שומן רב בלתי רוויות.
Abstract
חומצות שומן חיוניות לתפקודים תאיים רבים. הם משמשים מולקולות אחסון אנרגיה יעילה כמו, מרכיבים את הליבה ההידרופובי של ממברנות, ולהשתתף במסלולי איתות שונים. Caenorhabditis elegans מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3. זה, בשילוב עם האנטומיה ומגוון של כלים גנטיים זמינים הפשוטים, להפוך אותו למודל אטרקטיבי ללמוד לתפקד של חומצות שומן. על מנת לחקור את המסלולים הגנטיים המתווכים את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו שיטה כדי להשלים את ג דיאטת elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות. תוספת היא אמצעי יעיל כדי לשנות את הרכב חומצות שומן של תולעים ויכולה לשמש גם כדי להציל את הפגמים במוטנטים חומצת שומן לקוי. השיטה שלנו משתמשת באגר נמטודות צמיחה הבינוני (NGM) בתוספת מלחי acidsodium השומן. חומצות השומן בתוספת הצלחות הפכו incorporaטד לממברנות של מקור החיידקים שבמזון, אשר לאחר מכן הוא נלקח על ידי ג elegans שניזונים מהחיידקים בתוספת. גם אנו מתארים פרוטוקול גז כרומטוגרפיה לעקוב אחר השינויים בהרכב חומצות שומן המתרחשים בתולעים בתוספת. זוהי דרך יעילה כדי להשלים את התזונה של אוכלוסיות קטנות וגדולות של ג elegans, המאפשר מגוון רחב של יישומים לשיטה זו.
Introduction
חומצות שומן הם מרכיבים חיוניים מבניים של ממברנות, כמו גם מולקולות אחסון אנרגיה יעילה. בנוסף, יכולות להיות ביקע חומצות שומן מקרומים תאיים על ידי lipases ולהיות שונה אנזימים כדי לייצר effectors איתות 1. חומצות שומן רב בלתי רוויות באופן טבעי (PUFAs) מכילות שניים או יותר קשרים כפולים cis. אומגה 3, חומצות השומן וחומצות שומן אומגה 6 נבדלות זה מזה המבוססים על עמדותיהם של קשרים כפולים ביחס לסוף מתיל של חומצת השומן. תזונה בריאה דורשת שתי אומגה 3, חומצות שומן אומגה 6 ו. עם זאת, תזונה מערבית עשירה במיוחד באומגה 6 וחומצות שומן ודלות באומגה 3, חומצות שומן. גבוהה של אומגה 6 לאומגה 3 יחס חומצת שומן קשורה לסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם ודלקת, עם זאת, הפונקציות מועילות ומזיקות המדויקים של חומצות שומן מסוימות אינן מובנות 2 כן. Elega Caenorhabditis התולעת העגולהNS הוא שימושי בחקר התפקוד של חומצות שומן כי זה מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3, כולל desaturase אומגה 3, פעילות שאינה קיים ברוב בעלי החיים 3,4. מוטנטים חסרי אנזימי desaturase חומצת שומן מצליחים לייצר PUFAs הספציפית, מה שמוביל למגוון של ליקויים התפתחותיים ונוירולוגי 4-6.
כדי לחקור את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו assay ביוכימיים בקנה אחד עם ניתוח גנטי הן באמצעות מוטציה וטכניקות לדפוק למטה RNAi בג elegans. תוספת של PUFAs הספציפית מושגת על ידי הוספת תמיסת מלח נתרן חומצת שומן למדיום אגר לפני המזיגה. התוצאה היא ספיגת PUFA על ידי א ' מקור מזון coli, שבו הוא מצטבר בקרומים חיידקיים. ג elegans לבלוע חיידקי PUFA המכיל, ותוספי תזונה די בכך כדי להציל את defects של מוטציות PUFA לקויות. תוספת של רוב חומצות שומן אין השפעות מזיקות על בעלי חיים מסוג בר, לעומת זאת, חומצות ספציפיות אומגה 6 וחומצות שומן, במיוחד חומצת dihomo גמא לינולנית (DGLA, 20:03 n-6) גורם להרס קבוע של ג תאי נבט elegans 7,8.
גז כרומטוגרפיה משמשת כדי לפקח על הספיגה של חומצות שומן בתוספת במקור חיידקי מזון (או OP50 או HT115), כמו גם בנמטודות. התוספת של Tergitol חומר הניקוי (NP-40) בתקשורת מאפשרת חלוקה שווה של חומצות שומן דרך כל הצלחת והספיגה יעילה יותר של חומצות שומן על ידי א ' coli ונמטודות. מצאנו כי חומצות שומן בלתי רוויות נלקחות בקלות על ידי חיידקים וג elegans, אבל הספיגה של חומצות שומן רוויות היא הרבה פחות יעיל. מאמר זה יתאר צעד אחר צעד כיצד להשלים את התקשורת אגר עם חומצות שומן, כמו גם כיצד לפקח על ספיגת חומצת שומן בהנמטודות דואר באמצעות גז כרומטוגרפיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה של תוספת של ג elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות בתזונה. כפי שהוזכר לעיל, יש להקפיד בהכנת צלחות PUFA תוספת בגלל אופי התגובה של הקשרים כפולים בPUFAs גורם לחומצות שומן אלו להיות רגישות לחמצון באמצעות חום ו11 אור. כדי למנוע חמצון, חשוב להוסיף PUFA למדי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכריס ובסטר לביצוע הניסויים הראשוניים שמוצגים באיור 3 תוצאות הנציג וג'ייסון ווטס וכריס וובסטר על הערות מועילות על כתב היד. מימון למחקר זה מסופק על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (ארה"ב) (R01DK074114) לJLW. זני נמטודות חלקם משמשים בעבודה זו סופקו על ידי המרכז לגנטיקת Caenorhabditis, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתיות מחקר (OD010440 P40).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
Riferimenti
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetica. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetica. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetica. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
