Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Summary

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Abstract

Trabalho recente mostra que o sistema nervoso central (SNC) de regeneração e tumorigénese envolve as populações de células estaminais (SCS) residentes no cérebro adulto. No entanto, os mecanismos dessas células normalmente quiescentes empregar para garantir o bom funcionamento das redes neurais, bem como o seu papel na recuperação de lesões e mitigação de processos neurodegenerativos são pouco compreendidos. Estas células residem nas regiões referidas como "ameias" que fornecem um ambiente de sustentação envolvendo os sinais de modulação de ambos os sistemas vasculares e imunológicas. O isolamento, manutenção e diferenciação de SCs do SNC em condições de cultura definidas que excluem fatores desconhecidos, torna acessíveis ao tratamento por meios farmacológicos ou genéticos, proporcionando, assim, uma visão sobre o seu comportamento in vivo. Aqui oferecemos informações detalhadas sobre os métodos de geração de culturas de SCs do SNC a partir de regiões distintas do cérebro adulto e abordagens para avaliar a sua dpotencial ifferentiation em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, in vitro. Esta técnica produz uma população homogénea de células como uma cultura em monocamada, que pode ser visualizado para estudar SCs indivíduo e da sua descendência. Além disso, pode ser aplicado através de vários sistemas de modelos animais e amostras clínicas, sendo utilizado anteriormente para prever respostas regenerativos no sistema nervoso adulto danificado.

Introduction

O dogma central da neurobiologia, previsto pelas observações fundamentais da citoarquitetura cerebral feita por Ramón Cajal Y. mais de um século atrás, considerou que a neurogênese era improvável após a adolescência, dada a complexidade das redes neurais encontrados no SNC ^1. Apesar do trabalho de Altman em 1960, e mais tarde Kaplan, demonstrando que ³ H-timidina poderia ser encontrado em neurônios maduros, indicando que, de fato, os neurônios estavam sendo geradas em áreas distintas do cérebro adulto, o dogma continuou a deter ^{2, 3.} Evidência continuou a montar com a pesquisa de Nottebohm descrevendo as mudanças sazonais no número de neurônios presentes no cérebro aves canoras ^4. Não foi até 1999, quando Gould et al trabalho. Publicado na geração de neurônios no hipocampo aumenta com o desempenho de tarefas de aprendizagem associativa em ratos, bem como as observações de Kornack e Rakic ​​demonstraçãoting continuou a neurogênese no macaco adulto que o conceito de um cérebro mais plástico menos rígido, foi reconhecido ^{5, 6.}

A pesquisa para a fonte celular para estes neurónios gerados de novo levar à descoberta de uma população particular de células estaminais (SCS), que residem em áreas do cérebro conhecida como nichos ^7. A zona subventricular e zona granular sub do hipocampo são consideradas como as duas principais regiões de origem neural ^8,9. As células isoladas a partir destes locais exibir a característica clássica de SCs derivados embrionárias ou fetais, a auto-renovação e diferenciação. No caso de células estaminais neurais (NSCs), que podem ser diferenciadas em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Além disso, estes SCs coloração positiva para os marcadores NSC fetais, tais como o intermediário nestina proteína de filamento ^10. Os trabalhos mais recentes destaca que SCs não pode ser limitado a estes two áreas, e são, de facto, localizada em todo o cérebro como uma grande população de células quiescentes fortemente associadas com a vascularização ^11.

As observações de que a CT são mobilizados em resposta a uma lesão sugere a possibilidade de ser capaz de utilizar estas células para fins regenerativos para ajudar na recuperação da doença neurodegenerativa e acidente vascular cerebral ^{12, 13.} Este não é, ao contrário do papel que as células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenhar na cicatrização dos tecidos conjuntivos, os quais são encontrados como células perivasculares que têm o potencial para se tornar osteoblastos, condrócitos e células adiposas ^14. No entanto, NSC não podem ser colhidas da mesma forma que as MSCs de medula óssea por aspiração de rotina e técnicas de centrifugação de gradiente de densidade e subsequentemente utilizado em terapias à base de células autólogas. Em consequência, outras fontes de células, tais como o uso de NSC fetais ou precursores neuronais derivadas embcélulas-tronco ryonic foram amplamente exploradas na doença animal e modelos de lesão com variados graus de sucesso ^15. Tecnologias de células-tronco pluripotentes induzidas, utilizando fontes de células somáticas oferecer uma outra avenida potencial para a produção de terapias baseadas em células terapeuticamente úteis para uma ampla gama de aplicações, superando a disponibilidade limitada e preocupações éticas sobre o uso de células embrionárias e tecidos fetais ^16. No entanto, a tradução clínica destes resultados tem provado ser uma tarefa difícil, como demonstrado nas lutas do tratamento de várias condições neurológicas com terapêutica baseada-SC aborda ^17,18, bem como um caminho tortuoso para aprovação das autoridades regulatórias. Como uma abordagem alternativa, a introdução de tratamentos farmacológicos específicos pode modular números NSC e facilitar a recuperação em modelos de doença de Parkinson e derrame ^19. Seja qual for a estratégia pode ser, a compreensão de como manipular eficazmente estas célulasrequer um sistema acessível in vitro.

Culturas de NSC pode ser realizada tanto como culturas agregadas, também conhecido como neurospheres, ou como uma monocamada ^8,20. Ambas as técnicas têm sido amplamente utilizados, o que permite o estabelecimento de condições de cultura definidos, ou seja, a utilização do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) ou o Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) como uma fonte de mitogénio, que fornecem para a expansão de precursores multipotenciais. Enquanto as culturas de neuroesferas podem ser mais adequados para estudar a capacidade de propagação clonal de um tipo de célula isolada, o sistema tem sido mostrado para produzir uma população mista de células durante a expansão ^21. Além disso, a estrutura fechada das neuroesferas faz manipulação farmacológica das células impraticável, e a interpretação da influência destes factores pode ter poderia ser confundidos devido ao microambiente estabelecida dentro do próprio neuroesfera. Culturas em monocamada, por outro lado, pode serutilizado em telas de elevada capacidade de bibliotecas de moléculas pequenas, proporcionando uma poderosa ferramenta para explorar os mecanismos de transdução de sinais que regulam o crescimento e diferenciação, SC, e abre a oportunidade de descobrir novos compostos que visam especificamente esta população de células.

Como consequência, a capacidade de gerar de forma reprodutível culturas de NSC adultas a partir de diferentes regiões de interesse no cérebro pode ser utilizado em um amplo espectro de aplicações de pesquisa, variando a partir de estudos de desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), para explorar novas abordagens de medicina regenerativa . O protocolo aqui apresentado demonstra como a dissecar e avaliar o potencial de diferenciação das SCs SNC isolada a partir do cérebro do roedor adulto.

Protocol

O trabalho adere à Declaração de Helsinski ea Demonstração animal ARVO. Os animais foram utilizados para a coleta de tecido e todos os métodos relevantes foram seguidos de acordo com as instruções do biotério da Universidade de Dresden. Os animais foram manipulados e alojados de acordo com as diretrizes federais alemães para o uso e cuidado de animais de laboratório, eo estudo foi aprovado pelo Landesdirektion Dresden. Favor consultar com política veterinária da sua instituição (IACUC ou outro board) sobr…

Representative Results

A identificação da região de interesse a partir da qual a colheita de células estaminais neurais é o primeiro passo crítico e irá definir a quantidade de tempo que demora a obter uma placa confluente de células. Por exemplo, o SVZ é uma área neurogénica clássica e, por conseguinte, tem uma proporção relativa mais elevada de células estaminais neurais. No entanto, a técnica aqui apresentada pode ser utilizada com outras regiões não frequentemente reconhecidas como tendo um potencial neurogénica robusta…

Discussion

Muitos dos passos críticos para o isolamento bem sucedido, expansão e diferenciação de células estaminais neurais do cérebro adulto são partilhados em comum com as técnicas de cultura de tecidos padrão. O objetivo de ter em mente é que NSCs isolados do cérebro adulto deve manter como muitas de suas características in vivo quanto possível (Figura 2J). Muitas vezes, um equilíbrio entre a necessária cautela e velocidade apropriada precisa ser atingido. O cuidado com o isolamento do …

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit