वयस्क दिमाग से काटा तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं तंत्रिका तंत्र के विकास के बुनियादी अनुसंधान से पुनर्योजी चिकित्सा में संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों की खोज को लेकर अनुप्रयोगों में उपयोग बढ़ रही हैं. इस प्रयोगात्मक परिणामों ध्वनि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इन कोशिकाओं को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया अलगाव और संवर्धन की स्थिति में कठोर नियंत्रण में आता है.
हाल ही में काम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उत्थान और tumorigenesis स्टेम कोशिकाओं की आबादी (एससी) वयस्क मस्तिष्क के भीतर निवासी शामिल है कि यह दर्शाता है. हालांकि, तंत्र इन सामान्य रूप से मौन कोशिकाओं उचित तंत्रिका नेटवर्क के कामकाज, साथ ही neurodegenerative प्रक्रियाओं की चोट और शमन से वसूली में उनकी भूमिका सुनिश्चित करने के लिए काम थोड़ा समझ रहे हैं. इन कोशिकाओं नाड़ी और प्रतिरक्षा प्रणाली दोनों से modulatory संकेतों को शामिल सम्भालने वाले वातावरण प्रदान करते हैं कि "आलों" के रूप में भेजा क्षेत्रों में रहते हैं. अज्ञात कारणों को बाहर जो परिभाषित संस्कृति शर्तों के तहत सीएनएस अनुसूचित जातियों के अलगाव, रखरखाव, और भेदभाव, इस प्रकार उनके vivo व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान, औषधीय या आनुवंशिक माध्यम से उपचार के लिए उन्हें सुलभ बना देता है. यहाँ हम वयस्क मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों से सीएनएस अनुसूचित जातियों की संस्कृतियों पैदा करने के लिए तरीकों पर विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं और अपने फैसले का आकलन करने के लिए दृष्टिकोणन्यूरॉन्स astrocytes, और इन विट्रो में oligodendrocytes में ifferentiation संभावित. इस तकनीक को व्यक्तिगत अनुसूचित जातियों और उनकी संतान का अध्ययन करने के लिए कल्पना की जा सकती है कि एक monolayer संस्कृति ही एक सजातीय सेल आबादी पैदावार. इसके अलावा, यह विभिन्न पशु मॉडल प्रणाली और नैदानिक नमूने भर में लागू किया जा सकता क्षतिग्रस्त वयस्क तंत्रिका तंत्र में पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया जा रहा है.
एक सदी पहले से अधिक रेमन वाई Cajal द्वारा किए गए मस्तिष्क cytoarchitecture की मौलिक टिप्पणियों द्वारा निर्धारित तंत्रिका जीव विज्ञान के केंद्रीय हठधर्मिता, किशोरावस्था सीएनएस 1 में पाया तंत्रिका नेटवर्क की जटिलता को देखते हुए बाद न्यूरोजेनेसिस संभावना नहीं थी कि आयोजित किया. 1960 के दशक में Altman का काम करते हैं, और बाद में कापलान, 3 एच thymidine वास्तव में न्यूरॉन्स वयस्क मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में उत्पन्न किया जा रहा था यह दर्शाता है कि परिपक्व न्यूरॉन्स में पाया जा सकता है कि प्रदर्शन के बावजूद, हठधर्मिता 2, 3 पकड़ जारी रखा. साक्ष्य Songbird दिमाग 4 में मौजूद न्यूरॉन्स की संख्या में मौसमी बदलाव का वर्णन Nottebohm के अनुसंधान के साथ माउंट करने के लिए जारी रखा. यह 1999, जब तक नहीं था जब चूहे में साहचर्य सीखने कार्यों का प्रदर्शन, साथ ही Kornack और Rakic प्रदर्शन है की टिप्पणियों के साथ हिप्पोकैम्पस बढ़ जाती है में न्यूरॉन्स की पीढ़ी पर गोल्ड एट अल. प्रकाशित कामting एक कम कठोर, अधिक प्लास्टिक मस्तिष्क की अवधारणा, 5 पहचाना गया था कि वयस्क मकाक, 6 में neurogenesis जारी रखा.
इन नए सिरे से उत्पन्न न्यूरॉन्स के लिए सेलुलर स्रोत के लिए खोज 7 niches के रूप में भेजा मस्तिष्क के क्षेत्रों में रहते हैं कि स्टेम कोशिकाओं (एससी) के एक असतत आबादी की खोज को बढ़ावा. subventricular क्षेत्र और हिप्पोकैम्पस के उप बारीक क्षेत्र दो प्रमुख तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों 8,9 माना जाता है. इन स्थानों से अलग कक्षों क्लासिक भ्रूण या भ्रूण व्युत्पन्न अनुसूचित जातियों की विशेषता, आत्म नवीकरण और भेदभाव की क्षमता प्रदर्शित करते हैं. तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के मामले में, वे न्यूरॉन्स astrocytes, और oligodendrocytes में भेदभाव किया जा सकता है. इसके अलावा, इन अजा ऐसे मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन nestin के रूप में 10 भ्रूण एनएससी मार्करों के लिए सकारात्मक दाग. और हाल ही में काम अजा इन टी तक ही सीमित नहीं किया जा सकता है पर प्रकाश डाला गयाक्षेत्रों wo, और वास्तव में कसकर vasculature 11 के साथ जुड़े कोशिकाओं के एक बड़े पैमाने पर मौन जनसंख्या के रूप में मस्तिष्क में स्थानीयकृत हैं.
अनुसूचित जातियों चोट के जवाब में जुटाए हैं कि टिप्पणियों neurodegenerative विकार और स्ट्रोक 12, 13 से वसूली में सहायता करने के लिए पुनर्योजी उद्देश्यों के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने में सक्षम होने की संभावना का सुझाव है. इस अस्थिकोरक, chondrocytes, और वसा कोशिकाओं के 14 बनने की क्षमता है कि परिवाहकीय कोशिकाओं के रूप में पाए जाते हैं जो mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) संयोजी ऊतक की चिकित्सा में खेलने उस भूमिका के विपरीत नहीं है. हालांकि, एनएससी दिनचर्या आकांक्षा और घनत्व ढाल centrifugation तकनीक से अस्थि मज्जा से MSCs के रूप में एक ही तरीके से काटा नहीं जा सकता है और बाद में ऑटोलॉगस सेल आधारित चिकित्सा में उपयोग किया. एक परिणाम के रूप में, इस तरह के EMB से व्युत्पन्न भ्रूण एनएससी या neuronal व्यापारियों के उपयोग के रूप में कोशिकाओं के अन्य स्रोतों,ryonic स्टेम कोशिकाओं बड़े पैमाने पर सफलता 15 की डिग्री के साथ अलग जानवरों की बीमारी और चोट के मॉडल में लगाया गया है. दैहिक सेल के सूत्रों का उपयोग प्रेरित pluripotent स्टेम सेल प्रौद्योगिकी सीमित उपलब्धता और भ्रूण कोशिकाओं और भ्रूण के ऊतकों 16 के उपयोग के संबंध में नैतिक चिंताओं पर काबू पाने के लिए आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए therapeutically उपयोगी सेल आधारित चिकित्सा के उत्पादन के लिए एक अन्य संभावित एवेन्यू प्रदान करते हैं. हालांकि, इन निष्कर्षों के नैदानिक अनुवाद 17,18, साथ ही नियामक मंजूरी के लिए एक कपटपूर्ण पथ दृष्टिकोण अनुसूचित जाति आधारित चिकित्सीय साथ विभिन्न स्नायविक शर्तों के उपचार के संघर्ष में प्रदर्शन के रूप में, एक मुश्किल काम साबित हो गया है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, विशिष्ट औषधीय उपचार की शुरूआत एनएससी संख्या मिलाना और पार्किंसंस रोग और स्ट्रोक 19 के मॉडल में वसूली की सुविधा कर सकते हैं. रणनीति, प्रभावी ढंग से इन कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए समझ कैसे किया जा सकता है जो कुछ भीएक सुलभ इन विट्रो प्रणाली की आवश्यकता है.
एनएससी की संस्कृति भी neurospheres के रूप में जाना कुल संस्कृतियों, के रूप में या एक monolayer 8,20 के रूप में या तो किया जा सकता है. दोनों तकनीकों का व्यापक रूप से multipotent व्यापारियों के विस्तार के लिए प्रदान कि परिभाषित संस्कृति की स्थिति, एक माइटोजन स्रोत के रूप में epidermal वृद्धि कारक (EGF) या बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) यानी उपयोग करते हैं, की स्थापना की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया गया है. Neurosphere संस्कृतियों एक अलग सेल प्रकार का क्लोन प्रजनन क्षमता के अध्ययन के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है, सिस्टम विस्तार 21 के दौरान कोशिकाओं का एक मिश्रित आबादी का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, neurospheres के बंद संरचना कोशिकाओं के औषधीय हेरफेर अव्यावहारिक बना देता है, और इन कारकों हो सकता है प्रभाव की व्याख्या के कारण neurosphere के भीतर ही स्थापित microenvironment को चकित किया जा सकता है. Monolayer संस्कृतियों, दूसरे हाथ पर, हो सकता हैअनुसूचित जाति विकास और भिन्नता को विनियमित करने और विशेष रूप से इस सेल की आबादी लक्ष्य है कि उपन्यास यौगिकों की खोज करने के अवसर को खोलता है कि संकेत पारगमन तंत्र का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने, छोटे अणु पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीन में कार्यरत हैं.
एक परिणाम के रूप में, reproducibly मस्तिष्क में ब्याज के विभिन्न क्षेत्रों से वयस्क एनएससी की संस्कृतियों उत्पन्न करने की क्षमता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास के अध्ययन से उपन्यास पुनर्योजी चिकित्सा तरीकों की खोज को लेकर शोध आवेदनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है . यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल काटना और वयस्क कृंतक मस्तिष्क से अलग सीएनएस अनुसूचित जाति के भेदभाव की क्षमता का आकलन करने के लिए कैसे करें.
सफल अलगाव, विस्तार, और वयस्क मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण कदम से कई मानक टिशू कल्चर तकनीक के साथ आम में साझा कर रहे हैं. मन में सहन करने के लिए उद्देश्य वयस्क मस्तिष्क …
The authors have nothing to disclose.
Helmholtz एसोसिएशन की पहल और नेटवर्क फंड, वरना Kroener-फ्रेसेनियस फाउंडेशन से अनुदान, और ड्यूश Forschungsgemeinschaft से अनुदान के माध्यम से इमेजिंग और इलाज पर्यावरण चयापचय रोगों (- यह काम Helmholtz एलायंस ICEMED द्वारा (भाग) वित्त पोषित किया गया SFB 655: ऊतकों में कोशिकाओं).
6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | ||
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 |
5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
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Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution | |
Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | ||
DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation | |
Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | ||
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) | |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | ||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml | |
Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml | |
Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml | |
JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | ||
15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | ||
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | ||||
[header] | ||||
Immunofluorescence Reagents Table | ||||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | ||
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | ||
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol | |
[header] | ||||
Primary Antibody Table | ||||
Nestin | Chemicon | MAB353 |
Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
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Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
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Sox2 | R&D Systems | MAB2018 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
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CNPase | Chemicon | MAB326 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
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β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 |
Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
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Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 |
Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
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[header] | ||||
Secondary Antibody Table | ||||
Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
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Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
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Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |