Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Summary

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Abstract

Un recente lavoro dimostra che il sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e tumorigenesi coinvolge popolazioni di cellule staminali (SCS) residenti all'interno del cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi di queste cellule normalmente quiescenti impiegano per assicurare il corretto funzionamento delle reti neurali, così come il loro ruolo nel recupero da un infortunio e la mitigazione dei processi neurodegenerativi sono poco capito. Queste cellule risiedono nelle regioni denominate "nicchie" che forniscono un ambiente di sostegno che coinvolgono i segnali modulanti sia dal vascolare e immunitario. L'isolamento, la manutenzione e la differenziazione di CS del sistema nervoso centrale in condizioni di coltura definite che escludono fattori sconosciuti, li rende accessibili al trattamento con mezzi farmacologici o genetici, fornendo così spaccato il loro comportamento in vivo. Qui offriamo informazioni dettagliate sui metodi per la generazione di colture di SC SNC da regioni distinte del cervello adulto e approcci per valutare la loro dpotenziale ifferentiation in neuroni, astrociti, oligodendrociti e in vitro. Questa tecnica produce una popolazione omogenea di cellule come una coltura monostrato che può essere visualizzato per studiare individuale SC e la loro progenie. Inoltre, può essere applicato a diversi sistemi modello animale e campioni clinici, utilizzato in precedenza per prevedere le risposte di rigenerazione nel sistema nervoso adulto danneggiato.

Introduction

Il dogma centrale della neurobiologia, stabilito dalle osservazioni fondamentali del citoarchitettura cervello fatto da Ramón Y. Cajal oltre un secolo fa, ha dichiarato che la neurogenesi è improbabile dopo l'adolescenza data la complessità delle reti neurali presenti nel sistema nervoso centrale ^1. Nonostante il lavoro di Altman nel 1960, e successivamente Kaplan, dimostrando che ³ H-timidina è stato trovato in neuroni maturi che indicano che in realtà neuroni venivano generati in zone distinte del cervello adulto, il dogma continuato a tenere ^{2, 3.} La prova ha continuato a montare con la ricerca di Nottebohm descrivere i cambiamenti stagionali nel numero di neuroni presenti nel cervello Songbird ^4. Non è stato fino al 1999, quando Gould et al. Lavoro pubblicato sulla generazione di neuroni nell'ippocampo aumenta con l'esecuzione di compiti di apprendimento associativo nel ratto, nonché le osservazioni di Kornack e Rakic ​​dimostrazioneting continuato neurogenesi nel macaco adulto che il concetto di una meno rigida, cervello più plastico, è stato riconosciuto ^{5, 6.}

La ricerca della sorgente cellulare di questi neuroni de novo generati portato alla scoperta di una popolazione discreta di cellule staminali (SC) che risiedono in aree del cervello denominato nicchie ^7. La zona subventricular e sub zona granulari dell'ippocampo sono considerate le due principali regioni neurogenici ^8,9. Le cellule isolate da questi luoghi mostrano la classica caratteristica del SCs derivate embrionali o fetali, self-renewal e potenziale di differenziazione. Nel caso di cellule staminali neurali (NSC), possono essere differenziati in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Inoltre, questi SC macchia positivo per fetali marcatori NSC come il filamento intermedio proteina nestin ^10. Lavori più recenti sottolinea che SC potrebbero non essere limitate a queste two aree, e sono infatti localizzati in tutto il cervello come una popolazione in gran parte quiescente di cellule strettamente associati al sistema vascolare ^11.

Le osservazioni che la SCS sono mobilitati in risposta al danno suggerisce la possibilità di essere in grado di utilizzare queste cellule per scopi rigenerativi per aiutare nel recupero dalla malattia neurodegenerativa e ictus ^{12, 13.} Questo non è dissimile il ruolo che le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono nella guarigione dei tessuti connettivi, che si trovano come cellule perivascolari che hanno il potenziale di diventare osteoblasti, condrociti e cellule adipose ^14. Tuttavia, NSC non possono essere raccolti nello stesso modo come MSC da midollo osseo di aspirazione routine e densità gradiente tecniche di centrifugazione e successivamente utilizzati in terapie cellulari basate autologhe. Di conseguenza, altre fonti di cellule, come l'uso di cellule staminali neurali fetali e precursori neuronali derivate da embLe cellule staminali ryonic sono state ampiamente esplorate in malattie animali e modelli di pregiudizio con vari gradi di successo ^15. Tecnologie di cellule staminali pluripotenti indotte che utilizzano fonti di cellule somatiche offrono un'altra viale potenziale per la produzione di terapie cellulari terapeuticamente utili per una vasta gamma di applicazioni, superando la limitata disponibilità e preoccupazioni etiche riguardanti l'uso di cellule embrionali e tessuti fetali ^16. Tuttavia, la traduzione clinica di questi risultati ha dimostrato di essere un compito difficile, come dimostrato nelle lotte di trattamento di varie condizioni neurologiche con terapeutico basato-SC approcci ^17,18, così come un percorso tortuoso di gioco regolamentare. Come approccio alternativo, l'introduzione di specifici trattamenti farmacologici in grado di modulare i numeri NSC e facilitare il recupero in modelli di malattia di Parkinson e ictus ^19. Qualunque sia la strategia potrebbe essere, capire come manipolare efficacemente queste cellulerichiede un sistema accessibile in vitro.

Culture del NSC possono essere eseguite sia come culture aggregati, noto anche come neurosfere, o come un monostrato ^8,20. Entrambe le tecniche sono stati ampiamente utilizzati, permettendo la creazione di condizioni di coltura definiti, cioè uso di Epidermal Growth Factor (EGF) o fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) come fonte mitogeno, che prevedono l'espansione di precursori multipotenti. Mentre colture di neurosfere può essere più adatto per studiare capacità propagazione clonale di un tipo di cellula isolata, il sistema ha dimostrato di produrre una popolazione mista di cellule durante l'espansione ^21. Inoltre, la struttura chiusa di neurosfere rende manipolazione farmacologica delle cellule impraticabile, e l'interpretazione dell'influenza questi fattori possono avere potrebbe essere confuso a causa del microambiente stabilito nella neurosfere stesso. Colture monostrato, d'altro canto, possono essereimpiegato in schermi ad alta produttività di librerie di piccole molecole, fornendo un potente strumento per esplorare i meccanismi di trasduzione del segnale che regolano la crescita e la differenziazione SC e si apre la possibilità di scoprire nuovi composti che colpiscono specificamente questa popolazione di cellule.

Di conseguenza, la capacità di generare riproducibile colture di NSC adulte provenienti da diverse regioni di interesse nel cervello può essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni di ricerca comprendono studi di sviluppo del sistema nervoso centrale (CNS) per esplorare nuovi approcci di medicina rigenerativa . Il protocollo presentato qui dimostra come sezionare e valutare il potenziale di differenziazione della SC SNC isolate dal cervello di roditori adulti.

Protocol

Il lavoro aderisce alla Dichiarazione di Helsinski e l'animale dichiarazione ARVO. Gli animali sono stati impiegati per la raccolta dei tessuti e tutti i metodi pertinenti sono state seguite secondo le istruzioni del stabulario dell'Università di Dresda. Gli animali sono stati maneggiati e custoditi secondo le linee guida federali tedesche per l'uso e la cura degli animali da laboratorio, e lo studio è stato approvato dal Landesdirektion Dresda. Si prega di consultare la politica veterinaria del proprio is…

Representative Results

Identificare la regione di interesse che per raccogliere le cellule staminali neurali è il primo punto critico e definirà la quantità di tempo necessario per ottenere un piatto confluenti di cellule. Ad esempio, la SVZ è una zona neurogena classico e ha quindi una relativa proporzione elevata di cellule staminali neurali. Tuttavia, la tecnica qui presentata può essere utilizzato con altre regioni spesso non riconosciuti come aventi un potenziale neurogena robusto nell'età adulta. Ai fini del presente protocoll…

Discussion

Molti dei passaggi critici all'isolamento successo, l'espansione e la differenziazione delle cellule staminali neurali dal cervello adulto sono condivise in comune con le tecniche di coltura di tessuti standard. L'obiettivo da tenere a mente è che le cellule staminali neurali isolate dal cervello adulto dovrebbe mantenere come molti dei loro caratteristiche in vivo come possibile (Figura 2J). Spesso un equilibrio tra la necessaria prudenza e velocità adeguata deve essere colpito. …

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit