大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

Summary

成人脳から採取した神経幹細胞は神経系の発達の基礎研究から再生医療の潜在的な臨床応用を探索範囲の用途に利用が増加している。これは実験的な成果を鳴らす重要なこれらの細胞を成長させるために使用される分離と培養条件に厳密な制御を行う。

Abstract

最近の研究は、中枢神経系（CNS）腫瘍形成は、再生および幹細胞の集団（SCの）成体の脳内に存在することを含むことを示している。しかし、これらの正常静止細胞は、神経回路網の適切な機能を確保するだけでなく、神経変性過程の傷害や緩和からの回復におけるそれらの役割に採用するメカニズムはほとんど理解されています。これらの細胞は、血管系および免疫系の両方から調節シグナルを含む維持環境を提供する「ニッチ​​」と呼ばれる地域に存在します。未知の要因を除外する規定された培養条件の下での分離、メンテナンス、およびCNS SCの分化は、従って、それらのin vivoでの行動への洞察を提供し、薬理学的または遺伝的手段による治療にそれらにアクセスできるようになります。ここでは、成人の脳の異なった領域から中枢神経系のSCの文化を生成する方法に関する詳細な情報を提供し、そのDを評価するために近づいたニューロン、アストロサイト、およびin vitroでオリゴデンドロサイトへのifferentiationポテンシャル。この技術は、個々のSCおよびその子孫を研究するために可視化することができる単層培養として均一な細胞集団が得られる。さらに、損傷した成体の神経系において回生応答を予測するために以前に使用されて、異なる動物モデル系および臨床試料の両端に印加することができる。

Introduction

神経生物学のセントラルドグマは、前世紀以上ラモン·Y.カハールによって行われた脳の細胞構築の基本的な観測が定めた、神経新生はCNS ¹で見つかったニューラルネットワークの複雑さを考えると、思春期の後にそうだったと判示した。 1960年代のアルトマンの作品、およびそれ以降のカプランは^、3 H-チミジンは、実際にはニューロンは、成体脳の異なる領域で生成されていたことを示している成熟した神経細胞で見つけることができることを実証しているにもかかわらず、定説は^2、3を保持し続けた。証拠は小鳥の脳⁴に存在するニューロンの数の季節変化を記述するノッテボームの研究をマウントし続けた。これはグールドらはラットの連合学習課題の性能だけでなく、Kornackとラキッチdemonstraの観察と海馬が増大するニューロンの生成に作品を発表1999年までではなかったティンは剛性が低く、より多くのプラスチック、脳の概念は^、5認識された大人のマカク^、6で神経新生を続けた。

これらの新たに生成された神経細胞のための細胞源の探索はニッチ⁷と呼ばれる脳の領域に存在する幹細胞（SCS）の離散的な人口の発見につながる。脳室下帯と海馬のサブ粒状ゾーンは二つの主要な神経性の地域^8,9であると考えられている。これらの場所から単離された細胞は、古典的な胚または胎児に由来するSCの特徴的な、自己再生および分化能を表示します。神経幹細胞（NSC）の場合、それらは、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化させることができる。さらに、これらのSCは、例えば、中間径フィラメントタンパク質ネスチン¹⁰胎児NSCマーカーについて陽性に染色。 SCSはこれらのTに限定されていない可能性があり、より最近の研究のハイライトエリア、WOとは、実際にはしっかりと血管系¹¹に関連する細胞の大部分は静止人口として脳全体にローカライズされています。

のSCが傷害に応答して動員される観察は、神経変性疾患および脳卒中^12,13からの回復を助けるために回生目的のために、これらの細胞を利用することができるという可能性を示唆している。これは、間葉系幹細胞（MSC）は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞¹⁴になる可能性がある血管周囲細胞として見出される結合組織の治癒において果たす役割とは違っていません。しかし、NSCは、ルーチン吸引および密度勾配遠心法によって骨髄からのMSCと同様にして採取することができないし、続いて自己細胞に基づく治療に利用する。結果として、そのようなEMBに由来する胎児ニューロンのNSC又は前駆体の使用などの細胞の他の源ryonic幹細胞が広範囲に成功¹⁵の様々な程度で、動物の病気や怪我モデルで検討されている。体細胞の供給源を利用して人工多能性幹細胞技術は、限られた在庫および胚細胞および胎児組織¹⁶の使用に関する倫理的な問題を克服する、広範囲の用途のために治療的に有用な細胞ベースの治療を製造するための別の潜在的な手段を提供する。しかし、これらの知見の臨床的変換は、SC-ベースの治療アプローチ^17,18と同様に、規制当局の認可を曲がりくねった経路で種々の神経学的状態を治療する闘争に示されているように、困難な作業であることが証明されている。別のアプローチとして、特定の薬理学的治療の導入は、NSC数を調節し、パーキンソン病および脳卒中¹⁹のモデルの回復を促進することができる。戦略は、効果的にこれらの細胞を操作する方法を理解することがありますどのようなアクセス可能なin vitroの系を必要とします。

NSCの培養物はまた、ニューロスフェアとしても知られている凝集体の培養物として、または単層^8,20のいずれかとして行うことができる。両方の技術は、広く、規定された培養条件の確立を可能にする、多能性前駆体の膨張を提供するマイトジェン源として上皮成長因子（EGF）または塩基性線維芽細胞成長因子（bFGFの） すなわち使用が使用されてきた。ニューロスフェア培養物が単離された細胞型のクローン増殖能力を研究するためのより適しているかもしれないが、システム²¹は、膨張時に細胞の混合集団を産生することが示されている。また、ニューロスフェアの密閉構造は、細胞の薬理学的操作が非現実的になり、これらの要因が持つ影響力の解釈は、ニューロスフェア自体の中で確立された微小環境に混乱する可能性があります。単層培養物は、他の一方で、あることができるSCの増殖および分化を調節し、特にこの細胞集団を標的とする新規化合物を発見する機会を開くシグナル伝達機構を探索するための強力なツールを提供する、小分子ライブラリーのハイスループットスクリーニングに用いられる。

その結果、再現可能脳内の関心の異なる領域からの成体NSCの培養物を生成する能力は、中枢神経系（CNS）の発達の研究からの新規な再生医療アプローチを探索するに至るまで、研究用途の広いスペクトルにおいて使用することができる。ここで紹介するプロトコルは、成人の齧歯類脳から単離されたCNS SCの分化能力を分析し、評価する方法を示しています。

Protocol

仕事はHelsinskiの宣言とARVO動物ステートメントに準拠しています。ドレスデン大学の動物施設の指示に従って、動物は組織収集のために使用された、関連するすべてのメソッドに従った。動物は処理され、収容された実験動物の使用とケアのためのドイツ連邦ガイドラインに従って、および研究はLandesdirektionドレスデンで承認されたされた。適切な安楽死の方法論について、あなたの機関の獣…

Representative Results

神経幹細胞を採取するための関心領域を識別することは重要な第一歩であり、それは細胞のコンフルエントなプレートを取得するのにかかる時間の量を定義する。例えば、SVZは、古典的な神経原性領域であり、従って、神経幹細胞のより高い相対的割合を有している。しかしながら、ここに記載した技術は、多くの場合、成人期にロバスト神経原性ポテンシャルを有すると認識されていない?…

Discussion

成功した分離、拡大、及び成体脳由来の神経幹細胞の分化にとって重要なステップの多くは、標準的な組織培養技術に共通に共有される。心に留めて目的は、成人の脳から単離されたNSCは、できるだけそれらのインビボ特性（ 図2J）の多くを維持するべきであるということです。多くの場合、必要​​な注意と適切な速度のバランスが打たれる必要がある。頭蓋骨から脳?…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit