Нервные стволовые клетки, полученные от взрослого мозга увеличиваются используются в приложениях, начиная от фундаментальных исследований развития нервной системы к изучению потенциальных клинического применения в регенеративной медицине. Это делает строгий контроль в изоляции и культивирования условиях используются для выращивания этих клеток критические звучать экспериментальные результаты.
Последние работы показывает, что центральная нервная система (ЦНС) регенерация и туморогенез включает популяции стволовых клеток (SCS) резидентов в взрослом мозге. Однако механизмы эти обычно покоящиеся клетки используют для обеспечения надлежащего функционирования нейронных сетей, а также их роль в восстановлении от травмы и смягчения нейродегенеративных процессов мало понятны. Эти клетки находятся в регионах называемые "ниши", которые обеспечивают поддержание производства среды с участием модулирующие сигналы от обоих сосудистой и иммунной систем. Изоляция, техническое обслуживание, и дифференциация ЦНС СК при определенных условиях культивирования, которые исключают неизвестные факторы, делает их доступными для лечения фармакологическими или генетических средств, обеспечивая тем самым понимание их поведения в естественных условиях. Здесь мы предлагаем подробную информацию о методах генерации культуры ЦНС СК из различных регионов мозга взрослого человека и подходов для оценки их дifferentiation потенциал в нейроны, астроциты и олигодендроциты в пробирке. Эта методика дает гомогенную популяцию клеток как монослойной культуре, которые могут быть визуализированы изучать индивидуальный СКС и их потомство. Кроме того, он может быть применен в различных животных моделях и клинических образцах, используемого ранее для прогнозирования регенеративные реакции в поврежденной взрослой нервной системы.
Центральная догма нейробиологии, заложены фундаментальные наблюдений цитоархитектуры мозга, сделанного Рамон Ю. Cajal более века назад, постановил, что нейрогенез вряд после подростковый учитывая сложность нейронных сетей, находящихся в ЦНС 1. Несмотря на работу Альтмана в 1960, и позже Каплан, демонстрируя, что 3 Н-тимидина можно найти в зрелые нейроны, указывающих, что на самом деле были генерируется нейроны в различных областях мозга взрослого человека, догма продолжали удерживать 2, 3. Доказательства продолжали расти с исследованиями Ноттебом, описывающие сезонные изменения числа нейронов, присутствующих в певчих птиц мозг 4. Он не был до 1999 года, когда Гулд и др.. Опубликованная работа по генерации нейронов в гиппокампе увеличивается с выполнением ассоциативных учебных задач у крыс, а также наблюдениям Kornack и Rakić демонстратин продолжал нейрогенез во взрослом макаки, что понятие менее жесткой, более пластиковой мозга, был признан 5, 6.
Поиск сотового источника для этих De Novo, генерируемых нейронами привести к открытию дискретного населения стволовых клеток (ПК), которые находятся в областях мозга, называют ниши 7. Субвентрикулярной зоне и суб гранулированный зона гиппокампа считаются двумя основными нейрогенные регионы 8,9. Клетки, выделенные из этих мест отобразить классический характеристику эмбриональным, полученных СК, самообновление и дифференцировку потенциал. В случае нервных стволовых клеток (НСК), они могут быть дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты,. Кроме того, эти СК пятно положительным для плода маркеров, таких как NSC промежуточного нестина белка нить 10. Более поздние работы подчеркивается, что СК не могут быть ограничены эти тWO областей, и на самом деле локализованы по всему мозгу, как в значительной степени покоя популяции клеток плотно связанных с сосудистой 11.
Наблюдения, которые СК будут мобилизованы в ответ на повреждение предполагает возможность быть в состоянии использовать эти клетки для восстановительных целей, чтобы помочь в восстановлении от нейродегенеративных расстройств и инсульта 12, 13. Это мало чем отличается от той роли, которую мезенхимальные стволовые клетки (МСК), играть в исцелении соединительной ткани, которые находятся как периваскулярных клеток, которые имеют потенциал, чтобы стать остеобласты, хондроциты, и жировые клетки 14. Тем не менее, NSCs не могут быть собраны таким же образом, как МСК из костного мозга путем рутинного аспирации и градиент плотности методами центрифугирования, а затем использованы в аутологичных клеток на основе терапии. Как следствие, другие источники клеток, таких как использование фетальных НСК или нейрональных предшественников, полученных из набryonic стволовые клетки были широко изучены при болезни животных и моделей травмы с разной степенью успеха 15. Индуцированные технологии плюрипотентных стволовых клеток, использующие соматические источники клеток Предлагаю другую потенциальную возможность для получения терапевтически полезных клеточной терапии для широкого спектра приложений, преодолевая ограниченную доступность и этические проблемы, касающиеся использования эмбриональных клеток и тканей плода 16. Однако клинический перевод этих результатов оказалась трудной задачей, как показано в борьбе лечения различных неврологических заболеваний с SC-основе терапевтических подходов 17,18, а также извилистый путь к нормативной оформления. В качестве альтернативного подхода, внедрение конкретных фармакологического лечения может модулировать номера НСК и содействия восстановлению в моделях болезни Паркинсона и инсульта 19. Какой бы ни была стратегия может быть, понимание того, как эффективно манипулировать эти клеткитребуется доступную систему в пробирке.
Культуры НСК может быть выполнена либо в виде совокупности культур, также известный как нейросферы, или в виде монослоя 8,20. Оба метода широко используются, что позволяет для создания определенных условиях культивирования, т.е. использования эпидермального фактора роста (EGF) или основной фактор роста фибробластов (BFGF) в качестве источника митоген, которые предоставляют для расширения мультипотентными прекурсоров. В то время как нейросфера культуры могут быть лучше подходит для изучения клональную возможность распространения изолированной типа клеток, система, как было показано производить смешанную популяцию клеток в процессе расширения 21. Кроме того, закрытая структура нейросферы делает фармакологическая манипуляция клеток непрактично, а интерпретация влияния этих факторов может иметь может быть посрамлены из-за микросреды, созданной в самой нейросфера. Однослойные культуры, с другой стороны, может бытьзанятых в высокой пропускной экранах небольших библиотек молекул, что является мощным инструментом для изучения механизмов передачи сигналов, которые регулируют рост SC и дифференцировку и открывает возможность открыть для себя новые соединения, которые специально направлены эту популяцию клеток.
Как следствие, способность генерировать воспроизводимо культур взрослых НСК из различных регионов интереса в головном мозге может быть использован в широком спектре применений исследования, начиная от исследований в развитии центральной нервной системы (ЦНС), чтобы исследовать новые подходы регенеративной медицины . Протокол, представленные здесь показано, как препарировать и оценить дифференциацию потенциал ЦНС СК, выделенных из мозга взрослых грызунов.
Многие шаги, важных для успешного изоляции, расширения и дифференциации нервных стволовых клеток из мозга взрослого человека являются общими общего с стандартными методами культивирования тканей. Цель иметь в виду, является то, что НСК, выделенные из мозга взрослого человека должны п?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась (частично) Гельмгольца Альянс ICEMED – визуализации и отверждения окружающей среды метаболических заболеваний в рамках инициативы и сети Фонда имени Гельмгольца, грантом Else Kroener-Fresenius Foundation, и гранта от Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: Клетки в тканях).
6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | ||
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 |
5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
|
Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution | |
Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | ||
DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation | |
Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | ||
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) | |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | ||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml | |
Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml | |
Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml | |
JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | ||
15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | ||
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | ||||
[header] | ||||
Immunofluorescence Reagents Table | ||||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | ||
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | ||
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol | |
[header] | ||||
Primary Antibody Table | ||||
Nestin | Chemicon | MAB353 |
Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
|
Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
|
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
|
CNPase | Chemicon | MAB326 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
|
β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 |
Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
|
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 |
Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
|
[header] | ||||
Secondary Antibody Table | ||||
Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
|
Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
|
Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |